本实验室根据以往对中医药抗多器官纤维化研究的积累,通过对中医“异病同治”理论内涵的深入思考,结合现代医学研究成果,提出了中医药干预多器官纤维化作用于“骨髓-血液-靶器官”轴的假设。已有研究发现成人外周血中存在一种与多器官纤维化疾病相关的白细胞亚群——循环纤维细胞具有分泌细胞外基质的功能,来源于骨髓,存在于外周血,是一种过渡型细胞,能够随血液迁移到损伤组织中,进一步分化、成熟为成纤维细胞和肌成纤维细胞。[目的]从成人外周血中分离、纯化循环纤维细胞,建立起稳定、可靠的培养手段和鉴定方法,了解体外培养的循环纤维细胞的生物学特征和功能,建立起循环纤维细胞体外分化、生成细胞外基质的细胞模型,并在以往研究复方鳖甲软肝方防治多器官纤维化的基础上,进一步探讨方中的两个组成药物:黄芪和莪术的药理血清对循环纤维细胞的干预作用。[方法]实验采用Ficoll梯度密度离心的方法分离成人外周血,获得“白衣”层单个核细胞后,研究了接种密度、共培养时间、血清浓度等因素对循环纤维细胞培养、分化的影响。结合流式细胞检测技术、细胞免疫荧光染色和细胞化学染色技术,对体外培养的人循环纤维细胞进行了鉴定,并与人骨髓间充质细胞、人胚肺成纤维细胞和人血管内皮细胞进行了比较,同时通过扫描电镜和透射电镜观察,进一步对循环纤维细胞的形态进行了鉴定。通过天狼星红染色、羟脯氨酸含量测定和Western blotting比较了不同培养时期的人循环纤维细胞和人胚肺成纤维细胞的形态学特征和功能。在对人循环纤维细胞体外进行培养、分化研究的基础上,进一步研究了复方鳖甲软肝方中的两个药物:黄芪和莪术的药理血清对循环纤维细胞增殖和胶原合成能力的影响。[结果]1循环纤维细胞体外培养分化的特征体外培养的单个核细胞,1d后有细胞贴壁,细胞圆形、幼小;去除悬浮的淋巴细胞继续培养,这些贴壁的细胞在第3d即开始分化,出现大量成束幼小的长梭形细胞;7d后细胞开始生长变大,基本呈现成纤维细胞样形态;而到第15d细胞形态开始分化成熟,个体进一步生长,呈长梭形、纺锤形等,其大小和形态基本接近典型的成纤维细胞,细胞开始变得铺展、扁平而透明。经流式细胞仪分析,这些贴壁细胞到第9d即有83.5%细胞表达COLⅠ蛋白。2循环纤维细胞体外的培养影响因素高密度接种虽然有利于细胞贴壁,并能加速细胞的分化节奏,但同时也黏附了大量淋巴细胞,长期与大量淋巴细胞共存,对于贴壁细胞的分化是不利的,最终将中断其向成纤维细胞方向的分化,因此细胞贴壁后1d及时去除非贴壁细胞对于循环纤维细胞的非常关键。接种量为0.75×106PBMCs/cm2时,既能给所有细胞相互接触作用的机会,同时也可以通过细胞代谢迅速降低培养液的pH,这种条件下会明显促进贴壁细胞向长梭形的成纤维细胞样方向分化。循环纤维细胞在含10%和20%血清的DMEM培养液中均能生长,前者的分化速度较慢。3循环纤维细胞的超微结构扫描电镜下细胞间相互接触,呈明显的长梭形,核区微隆起,细胞有少数较粗的突起及纤细的丝状伪足。透射电镜显示细胞内的粗面内质网丰富、扩张;胞浆中有丰富的游离核糖体;高尔基体发达,在其成熟面可见大小不一的分泌囊泡;线粒体较多,体大而圆;细胞核较小,不规则,胞质丰富。循环纤维细胞具有成纤维细胞的典型形态学特征。4免疫荧光鉴定早期培养的循环纤维细胞表达干/祖细胞表面标记CD34和白细胞共同表面抗原CD45,伴随着循环纤维细胞在体外培养过程中分化、成熟,这两个表面标记逐渐消失,COLⅠ、COLⅢ表达增强。体外培养30d后终末分化的循环纤维细胞表达肌成纤维细胞标志物α-SMA,循环纤维细胞不表达血管内皮细胞标志物vWF。5循环纤维细胞产生细胞外基质的能力Western blotting检测了处于不同分化阶段的循环纤维细胞和人胚肺成纤维细胞分泌胶原的种类,结果表明这些细胞均表达Ⅰ型和Ⅲ型胶原。和人胚肺成纤维细胞相比,循环细胞培养液中胶原含量较低,而细胞层中沉积胶原的含量明显高于人胚肺成纤维细胞。6中药药理血清对循环纤维细胞的干预作用初步建立了循环纤维细胞体外分化、增殖和产生细胞外基质的细胞模型,探索了药理血清干预循环纤维细胞增殖和胶原合成两个环节的实验条件。通过药理血清干预细胞模型的研究,证明黄芪能够抑制胶原分泌减少培养液中羟脯氨酸的含量,莪术能抑制循环纤维细胞增殖。两药叠加对上述两个环节没有显著作用。[结论]建立了稳定、可靠的分离、培养人循环纤维细胞的方法。通过与人胚肺成纤维细胞、骨髓间充质细胞和血管内皮细胞的比较,证明了成人外周血中确实存在一种前体细胞——循环纤维细胞,经体外培养,能够分化为成纤维细胞。初步掌握了循环纤维细胞体外培养的特征,建立了体外模拟循环纤维细胞分化、增殖和产生细胞外基质的细胞模型。在此基础上,研究了中药黄芪和莪术药理血清对循环纤维细胞的干预作用,发现黄芪能够抑制胶原分泌减少培养液中羟脯氨酸的含量,莪术能抑制循环纤维细胞增殖。两药叠加对上述两个环节没有显著作用。