第一部分 特异性敲除巨噬细胞Tie 2受体对激光诱导小鼠脉络膜新生血管的影响目的:自噬在包括年龄相关性黄斑变性(AMD)在内的各种眼科疾病中起着至关重要的作用。表达Tie 2的巨噬细胞(TEMs)在血管生成中起关键作用。脉络膜新生血管(CNV)是新生血管型AMD的标志。目前还没有关于TEMs在新生血管型AMD的发生与发展过程中作用的研究。为此我们设计了本课题以研究TEMs和自噬在AMD中的作用。方法:我们选取特异性巨噬细胞Tie 2基因敲除小鼠,使用激光诱导的脉络膜新生血管模型。分别提取激光光凝后1天、3天、5天、1周和2周时间点的小鼠脉络膜提取RNA和蛋白,使用实时定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹实验检测其血管生成相关因子VEGF和自噬相关因子atg 5,atg 7,atg 12,BECN 1,LC3B和SQSTM 1的表达。为研究自噬在CNV过程中的作用,在激光前两天予小鼠玻璃体腔注射自噬抑制剂3-MA,观察小鼠脉络膜上VEGF和LC3B的变化。并在激光光凝后第7天行眼底荧光素钠造影(FFA),观察小鼠眼底荧光渗漏情况。结果:小鼠脉络膜上VEGF和自噬相关因子atg 5,atg 7,atg 12,BECN 1,LC3B和SQSTM 1的表达在激光光凝后升高,在第三天到达峰值,随后下降,至2周恢复正常水平。在激光光凝后第3天,特异性巨噬细胞Tie 2基因敲除小鼠脉络膜组织VEGF和LC3B的表达较对照组的表达下降。在使用3-MA抑制自噬后,小鼠脉络膜VEGF和LC3B的表达降低。FFA结果显示敲除小鼠巨噬细胞Tie 2基因组和注射自噬抑制剂3-MA组小鼠眼底荧光渗漏较对照组减轻,CNV面积减少。结论:特异性敲除小鼠巨噬细胞Tie 2受体,可以通过抑制自噬和VEGF的表达来抑制CNV的形成。推测TEMs可能通过调节VEGF的表达和自噬水平而影响CNV的形成。第二部分 特异性敲除Tie 2的小鼠腹腔巨噬细胞对血管内皮细胞体外生物学作用及机制的研究目的:前期实验已证实,特异性敲除小鼠巨噬细胞Tie 2受体,可以通过抑制自噬和VEGF的表达抑制CNV的形成。为进一步检测TEMs在CNV中的作用,我们观察巨噬细胞Tie 2敲除小鼠的腹腔来源巨噬细胞对血管内皮细胞的迁移、成管、VEGF表达和自噬的影响。同时还研究了敲除Tie 2的巨噬细胞的体外作用。方法:我们提取特异性巨噬细胞Tie2敲除小鼠的腹腔巨噬细胞,以巨噬细胞上清液来培养小鼠脑微血管内皮细胞,使用自噬抑制剂3-MA抑制自噬,通过划痕试验和transwell试验检测细胞迁移能力,管腔形成试验检测细胞成管能力。以巨噬细胞上清液培养血管内皮细胞24小时后,提取细胞总RNA和蛋白,使用实时定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹实验检测其血管生成相关因子VEGF、Ang-2和自噬相关因子 atg 5,atg 7,atg 12,BECN 1,LC3B 和 SQSTM 1 的表达。为观察敲除 Tie 2 的小鼠腹腔巨噬细胞的作用,我们检测了巨噬细胞的VEGF、LC3B和自噬相关信号通路mTOR和AMPK的表达,并且使用AMPK的激活剂AICAR,观察这些因子和信号通路的表达变化情况。结果:使用敲除Tie 2的巨噬细胞上清液相对于对照组的巨噬细胞上清液,抑制血管内皮细胞的迁移和成管能力,并且VEGF和LC3B的表达也下降。使用3-MA抑制自噬后,内皮细胞的迁移能力、成管能力、VEGF和表达和LC3B的表达也下降。在敲除Tie2的巨噬细胞中,VEGF、Ang-2、BECN 1、atg 7和LC3B的表达降低,AMPK信号通路受到抑制,mTOR信号通路活化。使用AMPK激活剂AICAR后,AMPK信号通路活化,VEGF和LC3B表达升高,mTOR信号通路受到抑制。结论:敲除Tie 2的巨噬细胞上清可能通过抑制自噬和VEGF来抑制细胞迁移能力和成管能力。敲除Tie 2的小鼠腹腔巨噬细胞可能通过激活AMPK信号通路来抑制自噬VEGF的表达。TEMs对自噬和VEGF介导的血管生成的调节可能是通过AMPK信号通路实现的。TEMs在CNV中起重要作用,有望成为预防新生血管性AMD的新靶点。