目的:2,2’,4,4’-四溴联苯醚（2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether,BDE-47）是人类暴露最多的多溴联苯醚同系物之一,研究证实其毒性作用涉及生殖、神经、内分泌等多个系统。流行病学研究显示BDE-47能够导致早产、低出生体重等不良妊娠结局,动物实验证明BDE-47能够在胎盘中蓄积并通过损伤胎盘导致小鼠不良妊娠结局,但具体机制仍在探索中。孕期母亲与胎儿间的物质交换依赖于胎盘,胎盘负责提供整个孕期胎儿生长所需要的全部营养物质,对于维持妊娠期间胎儿的生长至关重要。越来越多的证据表明胎盘结构和功能异常会导致许多不良妊娠结局。大量证据表明,许多胎盘发育异常和功能障碍是由于血管生成受损导致的,而胎盘血管生成过程依赖于滋养层细胞的适当侵袭,且滋养细胞增殖、凋亡和自噬的变化也与胎盘的正常发育息息相关。但是,BDE-47对胎盘结构和功能的影响暂不明确,亟需深入研究。p38 MAPK（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）是体内存在的一种不可或缺的丝氨酸和苏氨酸激酶,控制机体内多种细胞反应,对维持细胞存活非常重要。绒毛外滋养细胞的迁移、侵袭、增殖、凋亡和自噬等过程也需要p38 MAPK信号通路的参与。然而,p38 MAPK在BDE-47对胎盘的损伤过程中发挥的作用尚不清楚,有待进一步研究。因此,本研究通过建立妊娠期BDE-47暴露小鼠模型,研究BDE-47对小鼠妊娠结局的影响,并通过观察胎盘组织结构的变化情况,探究胎盘在BDE-47暴露所致小鼠不良妊娠结局中的作用,在机体水平上揭示BDE-47诱导生殖发育毒性的相关机制。同时以人绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo为体外研究模型,探讨BDE-47对HTR-8/SVneo细胞迁移、侵袭、增殖、凋亡和自噬的影响,研究p38 MAPK信号通路在其中的调控作用;从而阐明BDE-47暴露造成胎盘结构损伤和功能障碍的部分原因,为预防和控制BDE-47对妊娠的不良影响提供科学依据。研究方法:1、按体重将受孕ICR小鼠随机分配至4个实验组:对照组（玉米油）,25 mg/kg/day BDE-47染毒组,50 mg/kg/day BDE-47染毒组,100 mg/kg/day BDE-47染毒组。自受孕第0.5天至16.5天以灌胃的方式染毒,妊娠17.5天处死后观察BDE-47对小鼠体重、食物消耗量、水消耗量以及妊娠结局的影响;采用HE染色检测胎盘组织结构的变化情况;采用实时荧光定量PCR法检测胎盘发育相关基因Esx1、Ascl2、Hand1、Eomes和Fosl1的表达水平。2、以BDE-47染毒小鼠模型为基础,对胎盘组织中的CD34进行免疫组织化学染色,并采用Western blot法检测CD34和VEGF-A的表达水平,确定BDE-47暴露对小鼠胎盘血管生成的影响;采用ELISA法检测孕鼠血清中血管生成因子VEGF和胎盘生长因子Pl GF的表达水平;通过Western blot方法检测侵袭相关因子MMP9、MMP2、TIMP2、IGF1、IGFBP3的蛋白表达水平以及p38 MAPK信号通路的活化情况;应用实时荧光定量PCR法检测MMP9、MMP2和TIMP2的m RNA表达水平。用多个浓度的BDE-47对HTR-8/SVneo细胞进行染毒处理24小时后,CCK-8法检测细胞活力以确定BDE-47染毒剂量。接下来将细胞实验分为四组,分别为:对照组（DMSO）,5μM BDE-47染毒组,10μM BDE-47染毒组,20μM BDE-47染毒组。用细胞划痕愈合实验检测细胞的迁移能力变化;用Transwell实验检测细胞的侵袭能力变化;Western blot法检测VEGF-A和侵袭相关因子的蛋白表达水平以及p38 MAPK信号通路的活化情况。使用p38 MAPK信号通路的抑制剂SB203580抑制p38 MAPK信号通路的激活后,检测细胞迁移和侵袭能力的变化以及侵袭相关因子的蛋白表达水平。3、基于BDE-47染毒小鼠模型,采用免疫组织化学法检测胎盘组织中增殖相关因子Ki67和PCNA的表达水平;Western blot法检测胎盘组织中PCNA和CCND的表达水平;通过TUNEL荧光染色法观察胎盘细胞的凋亡情况;用Western blot法检测胎盘组织中凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Caspase9、cleaved-Caspase9、Caspase3、cleaved-Caspase3以及Cyt c的表达水平;通过实时荧光定量PCR法检测Bcl2、Bax、Caspase9和Caspase3的m RNA表达水平;采用Western blot和免疫组织化学法检测自噬标志性蛋白p62、Beclin1和LC3的表达水平。以BDE-47染毒的HTR-8/SVneo细胞模型为基础,应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化情况;其余增殖和凋亡的检测指标同动物实验;采用Western blot和免疫荧光染色法检测HTR-8/SVneo细胞自噬标志性蛋白的表达水平。使用SB203580抑制p38 MAPK信号通路激活后,检测细胞增殖、凋亡以及自噬相关指标的变化情况。结果:1、染毒期间,与对照组相比,所有BDE-47处理组孕鼠的体重和食物消耗量均发生明显降低,25和50 mg/kg/day BDE-47处理组孕鼠的水消耗量明显减少,50和100 mg/kg/day BDE-47暴露可显著增加孕鼠肝脏的脏器系数,而肾脏的脏器系数无明显变化,100 mg/kg/day BDE-47处理组胚胎数和活胎数明显减少,50 mg/kg/day BDE-47处理组的吸收胎数显著增加,100 mg/kg/day BDE-47处理组的子宫连胎重显著降低,25和50 mg/kg/day BDE-47处理组孕鼠的胎盘重量降低,且所有的BDE-47处理组胎盘面积、胎盘迷路层和海绵滋养层的面积均明显降低,50 mg/kg/day BDE-47处理组胎盘海绵滋养层面积和迷路层面积之比降低。除此之外,BDE-47暴露显著降低了Esx1、Ascl2、Hand1、Eomes和Fosl1等胎盘发育相关基因的m RNA表达水平。2、与对照组相比,BDE-47处理组的胎盘血管数量明显减少,孕鼠血清中VEGF和Pl GF的水平明显降低,胎盘组织中VEGF-A和侵袭相关因子MMP9、MMP2、TIMP2、IGF1、IGFBP3的蛋白表达水平明显降低,100 mg/kg/day BDE-47处理组MMP9的m RNA水平明显降低,三个BDE-47处理组的MMP2 m RNA水平显著降低,而TIMP2的m RNA水平无明显改变。HTR-8/SVneo细胞经染毒处理后,随着BDE-47处理剂量的增高,细胞活力逐渐下降。BDE-47处理能够抑制HTR-8/SVneo细胞中VEGF-A的表达水平,并降低细胞的迁移和侵袭能力,MMP9、MMP2、TIMP2、IGF1、IGFBP3的蛋白表达水平明显下降。在小鼠胎盘组织和HTR-8/SVneo细胞中BDE-47处理组p-p38的蛋白表达水平均显著升高,p38蛋白表达水平未发生明显变化。SB203580能够抑制由BDE-47处理引起的细胞内p-p38蛋白的升高。抑制p38 MAPK信号通路后,由BDE-47导致的VEGF-A表达水平的下降有所回升,且细胞迁移和侵袭能力的下降有所恢复,MMP9、MMP2、TIMP2、IGF1、IGFBP3的表达水平有所回升。3、与对照组相比,BDE-47处理能够显著降低胎盘组织中Ki67、PCNA和CCND的表达水平,BDE-47处理组凋亡细胞数明显增多,且凋亡相关因子Bcl2、Caspase9和Caspase3的表达水平显著降低,而Bax、cleaved-Caspase9、cleaved-Caspase3以及Cyt c的表达水平明显升高,所有BDE-47处理组的Bcl2的m RNA水平明显降低,100 mg/kg/day BDE-47处理组Bax的m RNA水平明显升高,而Caspase9和Caspase3的m RNA水平无明显改变,BDE-47处理组p62蛋白表达水平明显降低,Beclin1和LC3-II的蛋白表达水平明显升高。在HTR-8/SVneo细胞中,BDE-47处理组PCNA和CCND的蛋白表达水平明显降低,20μM BDE-47处理组S期细胞比例显著降低,10μM和20μM BDE-47处理组细胞凋亡率显著升高,抗凋亡蛋白Bcl2、Caspase9和Caspase3的表达水平显著降低,而促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase9、cleaved-Caspase3以及Cyt c的表达水平明显升高,BDE-47处理组p62的蛋白表达水平明显降低,Beclin1和LC3-II的蛋白表达水平明显升高。抑制p38 MAPK信号通路后,逆转了由BDE-47处理诱导的HTR-8/SVneo细胞G0/G1期阻滞,PCNA、CCND的蛋白表达水平有所回升,由BDE-47导致的细胞增殖能力的减弱有所恢复;且p38 MAPK信号通路的抑制降低了由BDE-47引起的细胞凋亡率的升高,与20μM BDE-47处理组相比,抑制p38 MAPK信号通路后,Bcl2的蛋白表达水平明显升高,Bax、cleaved-Caspase9、cleaved-Caspase3和Cyt c的表达水平明显降低;抑制p38 MAPK信号通路后,p62蛋白表达水平较BDE-47处理组有所升高,Beclin1和LC3-II蛋白表达水平降低。结论:1、BDE-47暴露能够降低孕鼠体重,影响孕鼠的食物和水消耗量,并通过影响胎盘的结构和降低胎盘发育相关基因的表达水平导致小鼠出现不良妊娠结局。2、BDE-47能够损害小鼠胎盘血管生成,激活小鼠胎盘组织和HTR-8/SVneo细胞中的p38 MAPK信号通路,且p38 MAPK信号通路参与BDE-47抑制HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的过程。3、BDE-47能够抑制小鼠胎盘组织和HTR-8/SVneo细胞的增殖、诱导细胞凋亡增加和自噬过度激活,p38 MAPK信号通路参与BDE-47诱导的HTR-8/SVneo细胞的增殖抑制、凋亡增加和自噬激活过程。