杜仲Eucommia ulmoides树皮相关微生物组的结构、功能及构建机制研究

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中药材产业是我国战略性新兴产业,是中医药工业和大健康产业的重要组成部分。微生物组是药用植物健康和生产力的重要决定因素,可直接影响其宿主的代谢组,从而影响药材品质。杜仲Eucommia ulmoides是一种具有丰富生物活性化合物的药食两用植物,是工业生产中杜仲胶的主要来源,具有较高的医药和经济价值。然而,目前的研究大多集中在其遗传育种、临床药物、工业运用等,缺乏对微生物组的组成、特定分类单元功能及群落构建等生态过程的基本认识。以我国27个杜仲产地的81份样品(树皮、根际土壤及树叶)为研究材料,通过高通量测序技术、液相色谱-串联三重四级杆飞行时间高分辨质谱(LC-QTOF MS/MS)、叶绿体DNA分子标记等方法与手段,1)系统评估成员(membership)、组成(composition)、系统发育和功能冗余(phylogenetic and functional redundancy)以及网络连接(network connection)4种核心微生物组界定方法的优势和局限性;2)揭示不同产地杜仲树皮微生物群落组成及分布特征;3)解析杜仲核心及稀有微生物类群的表型和代谢特征,以及它们与药理活性成分间的潜在关系;4)探究树皮微生物组、宿主遗传特征、气候及土壤理化因子对杜仲药理活性成分的影响;5)明确树皮微生物群落构建过程中确定性和随机性过程的相对重要性,探究宿主基因型、根际微生物组、气候因子、土壤理化及药用活性成分对微生物群落构建的影响。其主要结果如下:(1)核心微生物组的不同方法界定在组成和功能上存在一定偏好,但它们可能指一组对宿主或相关微生物组影响显著或重要的微生物类群。从组成数量上看,系统发育界定法包含275个核心OTUs,成员资格界定法包含10个核心OTUs,组成方式和网络连接界定法均包含5个核心OTUs;从考虑物种丰度看,系统发育和网络连接法更具有普遍性;相反的是,不同方法界定的核心微生物组在功能上具有相似性。基于此,我们提出:(I)应该根据所面对的生态学问题对核心微生物组的界定方法做出选择;(II)多种方法的结合可能全面揭示宿主不同层次的核心微生物组,了解宿主微生物相互作用的生态和进化过程。(2)杜仲树皮具有丰富的微生物类群。其中,真菌群落隶属于12门39纲103目239科469属1850 OTUs,优势真菌属为Sordariomycetes spp.,相对丰度为12.82%。细菌群落隶属于36门77纲160目319科614属1884 OTUs,优势细菌属为芽孢杆菌属Bacillus(12.27%)。总的来说,不同产地间的树皮微生物组的alpha多样性无显著差异,但beta多样性存在显著差异。进一步分析发现,树皮核心微生物群共包含11个分类单元。其中,5个真菌分类单元分别为长蠕孢霉Helminthosporium、格孢腔菌目Pleosporales一未鉴定属、Fusicolla、支顶孢属Acremonium、Paraconiothyrium;6个细菌分类单元分别为类诺卡氏属Nocardioides、分支杆菌属Mycobacterium、丛毛单胞菌科Comamonadaceae一未鉴定属、微杆菌科Microbacteriaceae一未鉴定属、Solirubrobacter及酸微菌科Acidimicrobiaceae中一未鉴定属。树皮稀有微生物群包含599个分类单元。其中,树皮真菌稀有类群包含瓶毛壳属Lophotrichus、絮缘衣属Byssoloma、Distoseptispora、白僵菌属Beauveria、Retiarius等281个分类单元;细菌稀有类群包含放线菌Actinomyces、毛螺菌科Lachnospiraceae一未鉴定属、Rheinheimera、糖多孢菌属Saccharopolyspora、Pannonibacter等318个分类单元。(3)树皮核心和稀有分类单元与微生物群落的结构稳定性、网络复杂度、宿主适应性及药理活性成分的积累密切相关。核心微生物群的生态功能主要为内生真菌、真菌寄生、植物病原和木腐菌;表型功能主要为有机营养型、化能异养型、嗜常温型和嗜热型微生物,代谢功能主要为化能异养和芳香族化合物降解。它们对药理活性成分的含量也显著相关,孢腔菌目Pleosporales spp.、支顶孢属Acremonium spp.及Paraconiothyrium spp.均与松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷及京尼平苷酸呈正相关关系。分支杆菌属Mycobacterium spp.和微杆菌科Microbacteriaceae spp.均与三种药理活性成分呈正相关关系。稀有微生物群的生态功能主要为木腐菌、植物病原菌、动物病原菌、地衣型真菌、内生真菌等,它们属异养型、自养型、甲基营养型、有机营养型的嗜常温型、嗜冷型和嗜热型微生物,其代谢功能主要为化能异养、发酵、尿素分解、甲醇氧化反应、甲基营养等。此外,我们的研究还发现,核心和稀有微生物群是维持树皮微生物群落网络结构和稳定性的关键分类单元,当移除核心和稀有分类单元后,微生物的网络结构发生了显著的变化。(4)遗传多样分析显示,杜仲所有样品共有12个不同的单倍型、种群无明显遗传异质性。不同产地之间杜仲树皮药理活性成分含量存在差异,松脂醇二葡萄糖苷(Pinoresinol diglucosid)的含量为14.76-40.07μg/m L、京尼平苷酸(Geniposidic acid)4.88-33.2μg/m L、桃叶珊瑚苷(Aucubin)的含量为13.99-44.5μg/m L。进一步分析发现,宿主基因型、环境条件(生物和非生物因子)及其互作均显著影响杜仲药理活性成分的积累,但基因型对杜仲药理活性成分的积累影响更大。其中,优势属乳杆菌属Lactobacillus、埃希氏菌属Escherichia、拟杆菌属Bacteroides及粪杆菌属Faecalibacterium均与3种药理活性活性成分的含量显著相关。(5)杜仲树皮微生物群落的构建同时受到确定性和随机性过程影响。与基因型相比,环境对树皮微生物群落构建的贡献更大。相对湿度、年平均温、有效氮、p H和京尼平苷酸为树皮微生物群落构建的主要影响因子。溯源分析表明,杜仲根际土壤可能是树皮微生物的主要来源之一。本研究系统揭示我国不同产地杜仲树皮相关微生物组的分类学组成、功能、构建机制及与药理活性成分间的潜在关系,为人工合成群落以调控杜仲微生物组的组装组成提供了综合性的实验证据,并为未来基于微生物组精准调控的可持续农业管理提供重要信息。
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