随着再生医学的兴起,利用组织工程支架和种子细胞修复受损组织/器官,成为近年来的研究热点。超临界流体技术,作为一种新型的绿色技术,有条件温和、不使用有机溶剂、操作简单等优点,逐渐在组织工程支架制备领域受到研究者的青睐。糖尿病是威胁人类健康的4种非传染性疾病之一,其患病人数逐年增长,糖尿病的根治变得迫在眉睫。利用组织工程的原理,将胰腺细胞负载于支架并植入体内;或是利用干细胞在体外高效地分化得到能分泌胰岛素的β-细胞,单独或是负载于支架后植入体内,以取代传统的胰岛素摄入治疗,在根治糖尿病方面表现出巨大的前景。然而,无论是对于支架制备亦或是干细胞体外分化的原理和方法,人们的理解尚浅。本文利用超临界CO2发泡技术,深入研究了简单发泡法和两步泄压发泡法中各操作因素对泡孔形成的影响,并对泡孔生长的机理进行了详细的阐述;同时,对人胚胎/多能干细胞（human embryonic stem cell/induced pluripotent stem cell,hESC/hiPSC）在体外分化胰岛始祖细胞的方法进行了研究,提出了一个体外诱导定型内胚层分化的新型路径,以及无Activin A/FGF的胰岛始祖细胞分化方法,为其在组织修复的应用研究奠定了基础。首先,利用超临界CO2简单发泡法,制备了具有单一模式孔的聚己内酯（polycaprolactone,PCL）支架,研究了保压时间、操作温度、操作压力和泄压速率对泡孔形貌和结构的影响。结果表明,在0.5-2 h范围内,延长保压时间,泡孔孔径变小而孔径分布越窄,超过2 h后由于样品中的CO2达到饱和,其孔径和孔径分布不再发生变化。操作温度对泡孔的影响最为显著,在35℃以下和60℃以上时,发泡均不能进行;在35-60℃范围内,随着温度升高,泡孔孔径从17.5±7.7 μm增长至150.8±37.2μm;特别地,研究发现超临界CO2导致PCL熔点降低,PCL的发泡模式会发生改变,在40℃以下表现为“固态发泡”,而在40℃以上则表现为“熔融态发泡”。操作压力对泡孔的影响很大程度依赖于操作温度,40℃时,操作压力在10-25 MPa范围内,泡孔孔径在20-30 μm波动;而60 ℃时,操作压力从25 MPa降低至10 MPa,泡孔孔径从25.2±4.3 μm增加至238 ± 32μm。泄压速率从5MPa降至0.005 MPa/s,泡孔孔径从23.8±5.0μm增大至345± 54 μm。关于孔隙率,温度是首要考虑的因素。35℃时的孔隙率只有60.8 ± 3.2%,而当温度高于40℃时,孔隙率达到最高并保持在80%左右。泄压速率对连通孔隙率的影响最大,泄压速率从0.03 MPa/s提高至5MPa/s,连通孔隙率从41%增至71%。在超临界CO2简单发泡法的基础上,将发泡流程改进为两步泄压发泡法,制备了具有双模式孔的PCL支架。研究发现,温度升高,大孔和小孔孔径越大且分布变宽,40℃时小孔和大孔的峰值分别位于35μm和140μm附近,而50℃时,则在70μm和160μm附近。保压时间在0.5h时只能制备出孔径为31.9±2.9μm的单一模式孔支架;在1-2h可得到双模式孔支架,随着保压时间延长,气核密度从（186±15）× 105/cm3增长到（215±81）× 105/cm3,并随着气核合并而大孔孔径增大,但小孔孔径不变。随着平衡时间在0.5-1 h范围内延长,大孔的泡孔密度从（3.17±0.48）× 1 05/cm3下降至（1.75±0.41）× 1 05/cm3。中间压力对泡孔的影响呈现出不同的规律,在7-12 MPa时,大孔和小孔的孔径都随着中间压力的降低而增大;中间压力在5-7Mpa范围内,大孔和小孔的孔径反而随着中间压力的降低而降低。利用发泡中断法,阐述了两步泄压发泡法的泡孔生长机理:（a）保压阶段,CO2进入聚合物基质;（b）第一步泄压阶段,大孔的前体成核并依中间压力的高低适当生长;（c）平衡阶段,样品中的CO2会在基质内重新分布达到稳态,第一步泄压阶段产生的气核在该阶段合并形成更大的气核/泡孔;（d）第二步泄压阶段,聚合物基质内的所有CO2逸出,一部分用于大孔体积的扩张,另一部分在未发泡区域成核、生长形成小孔,随着基质固化,得到了同时具有大孔和小孔的双模式孔支架。该机理对双/多模式孔支架制备具有借鉴意义。在以上发泡实验的基础上,利用细胞模型构建气泡生长的物理模型,研究了超临界CO2发泡过程种的泡孔形成过程。以Zaremba-Dewitt模型作为本构方程,通过动量衡算和质量衡算,推导了超临界CO2发泡过程中气泡在PCL基质中生长的数学模型。为了求解该模型,引入PC-SAFT状态方程模拟计算出CO2在PCL中的溶解度曲线,利用得到的溶解度数据计算出细胞模型所需要的初值条件。结合实验数据,将所有边界条件代入模型,模拟了不同操作压力和不同泄压速率条件下气泡在PCL中的生长曲线,其变化趋势和实验结果吻合较好,该模型可用于预测超临界CO2简单发泡法的泡孔生长过程。另外,对从hESC/hiPSC出发体外分化获得胰岛始祖细胞的方法进行了详细研究。发现了利用小分子化合物chir99021（CH）抑制GSK3β信号通路能够诱导内胚层细胞形成的方法。具体地,用2-6 μM的chir99021浓度处理细胞时,44.7%的H1细胞（hESC）在4 μM处能表达内胚层标记蛋白SOX17,82.5%的6-9-9细胞（iPSC）能在3 μM处表达SOX17,而在更低或更高的CH浓度下两种细胞表达SOX17的比例都会下降。基因插入细胞系H9-SOX17-mcherry（hESC）在3μM处有最高的mcherry表达也验证了这个现象。同时,发现利用骨形态发生蛋白（BMP）通路抑制剂dorsomorphin（DM）和CH同时处理细胞,能够显著提升SOX17的表达,从38.4%提升至78.1%。利用TGF-β通路抑制剂能够抑制CH诱导下SOX17表达,说明该诱导方法是通过TGF-β信号通路实现的。RT-qPCR结果显示,CH处理的细胞在D1时多能性标记（pluripotencymarker）Nanog和Oct4 的表达迅速下降,原条标记（primitive streak marker）T、Mixl1、GSC 在 D1-D2 出现瞬时表达,而内胚层标记（endodermmarker）Foxa2和SOX17表达量从D1至D4逐渐上升,表明了定型内胚层的分化发生。这些细胞在体外可进一步分化成为胰岛始祖细胞和肝芽细胞,证实了该细胞具有内胚层潜能。RNA测序结果表明,CH通过激活Nodal信号通路绕过Activin通路激活TGF-β通路,实现定型内胚层的诱导分化。利用CH+DM诱导获得的定型内胚层细胞,对胰岛始祖细胞的分化方法进行了优化。发现将分化阶段S3从2天延长至4天、在S3添加蛋白激酶C（PKC）激活剂PDBu和在S4添加50 μM ROCK抑制剂Y27632均能显著提升胰岛始祖细胞标记NKX6.1在细胞的表达。此外,在D4将细胞按1:6稀释可以将另一种胰岛始祖细胞标记PDX1表达提升至90%以上,但是会抑制NKX6.1在细胞中的表达,说明细胞密度对胰岛始祖细胞的分化有一定影响。最后,尝试了用成纤维生长因子2（FGF2）替换培养基中的FGF10,发现PDX1的表达不受影响;即使将FGF从培养基中完全移除,对PDX1和NKX6.1的表达也没有任何负面影响,说明本方法中胰岛始祖细胞的分化不依赖于FGF信号通路。论文利用超临界CO2发泡法,可以制备出具有不同孔径大小、不同孔结构的单/双模式孔PCL组织工程支架,研究结果有助于深入理解超临界CO2发泡法中泡孔生长过程;同时,利用新型的干细胞体外分化手段,可以高效地生产胰岛始祖细胞,将组织工程支架和种子细胞二者结合,对基于组织工程支架的组织/器官修复方法的实际应用具有重要的指导意义。