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Bcl-2 是在多种恶性肿瘤中高表达的癌基因, 通过抑制细胞凋亡促进癌细胞生存、 使癌细胞对化疗产生耐药 因此, Bcl-2 基因是反义寡核苷酸治疗恶性肿瘤的良好靶基因。 F951是福建省血液病研究所自行设计合成的与其它针对Bcl一基因门于洲A反义寡核营酸序列不同的反义硫代磷酸寡脱氧核营酸。为进一步研究F951在治疗人类恶性肿瘤方面的应用价值,使F951早日进入临床实验,本课题进行了F951治疗人小细胞肺癌的药效学实验研究,以高表达BC卜2基因的NC工任刊46细胞系为受试对象。第一部分实验通过皮下埋块法进行连续传代移植建立人小细胞肺癌NCI-H446 细胞裸鼠异种移植瘤模型, 并对移植瘤的生物学特性进行观察,结果确立经过三次连续传代移植的移植瘤为人小细胞肺癌 NCI-H446 细胞裸鼠移植瘤模型, 其潜伏期短、 不易自行消退, 瘤体经短暂潜伏期后呈进行性生长, 并可出现肝转移。 移植瘤细胞的组织形态与超微结构保留了NCI-H446 细胞的特点, 染色体检查证明为人类肿瘤细胞染色体核型 。 第二部分实验将F951单独或与化疗药物一一足叶乙试(即1司联合,用于治疗NCI--1玉」46细胞的裸鼠移植瘤。挑选瘤体大小约40--巧01丁n宝的荷瘤鼠随机分组后进行治疗,每组6只裸鼠。给药方式分为两种,一种为局部给药,对裸鼠进行瘤内注射(Inj ected Into the maSS oft咖r, It);另一种为全身给药,对裸鼠进行腹腔注射(i ntraPeritoneal,ip)。每种给药 1<WP=5>方式均分五组,分别为生理盐水对照组、FNS18无义对照组、即16治疗组、F951治疗组、F951十VP16治疗组。F95几每日一次,共治疗14天,瘤内注射的剂量为1011℃/kg腹腔注射的剂量为151119/kg vPI尽于F951治疗的第d,7天及第11一14天给药,每日一次,瘤内注射的剂量为吕119/k吕腹腔注射的剂量为1211℃/k吕通过瘤体积及瘤重的测量等观察药物治疗对瘤体生长情况的影响;通过生存期观察了解药物治疗对荷瘤鼠生存的影响;通过瘤块病理学光镜、电镜观察及卫则EL实验检测瘤体细胞凋亡情况;通过荧光定量RP于℃R检测瘤体细胞BC卜Zllf卜A水平、流式细胞仪检测瘤体细胞Bcl一蛋白表达以了解F951对Bcl一基因的特异性抑制作用。 F951单独瘤内注射或腹腔注射治疗的结果发现,FNS18无义对照组与生理盐水对照组在各检测指标上的差别无显著性,排除了无义序列的非特异性作用。反义药物F951治疗组与生理盐水对照组之间的差异则非常显著,首先是相对瘤体积(附文的变化,F951治疗组的附v与生理盐水对照组相比有显著性差异(R习.0匀,肿瘤生长抑制率超过5哪达到有效的生长抑制。瘤内注射治疗的瘤块100%日现完全退缩,腹腔注射治疗的瘤块SJ出现完全退缩。肿瘤生长延缓期较对照组明显延长,瘤内注射治疗的瘤块达到有效的生长延缓指数。治疗14天后的离体瘤块重量显著也低于生理盐水对照组,瘤内注射治疗的抑瘤率达82 020rk腹腔注射治疗的抑瘤率达7生1戏F951治疗组裸鼠生存期相对延长,治疗后120天生存率也明显高于对照组。 F951与VP16联合治疗的结果显示:F951与vP16联合瘤内注射组的6只荷瘤鼠中有4只的瘤块完全退缩3个月后仍不复发(F951一it治疗组只有1只,VPI 6--it治疗组则无),联合治疗组肿瘤生长持续缓慢,治疗后120天仍处于生长延缓期内,延缓指数大于5(F951一it治疗组生长延缓期为49天,延缓指数马VP16--it治疗组生长延缓期为63天,延缓指数2司;F951与VP16联合腹腔注射组的6只荷瘤鼠中有1只的瘤块完全退缩3个月后仍不复发,而两单独治疗组全无,肿瘤生长持续缓慢,生长延缓期为84天,延缓指数凡移植瘤生长速度明显低于两对照组(F95卜iP治疗组生长延缓期为42天,延缓指数L民VPI 6--iP治疗组生长延缓期为24天,延缓指数<WP=6>0.9。 以上观察结果表明:F951瘤内注射或腹腔注射治疗人小细胞肺癌NC工任玉146细胞裸鼠移植瘤有明显的疗效,与VP16联用效果更好。 病理切片、电镜超微结构和卫则EL实验结果显示F951瘤内注射或腹腔注射治疗组瘤细胞减少,瘤细胞有明显的凋亡现象。联合治疗组瘤细胞较相应的单独治疗组更稀少,凋亡后坏死现象明显,瘤组织纤维化严重。说明Fg 51可通过诱导瘤细胞凋亡达到治疗肿瘤的效果,联合治疗组细胞凋亡及坏死相结合,共同抑制肿瘤。 荧光定量RF于℃R结果显示F951治疗组瘤块细胞BC卜Zllf卜人拷贝数明显下降,流式细胞仪检测结果显示F951治疗组瘤块细胞BC卜2蛋白表达率下降,表明F951特异性下调了瘤细胞BCI一11于卜叭表达,进而抑制了瘤细胞内Bcl一2蛋白表达。 第三部分实验为体外的细胞学实验。通过MTT实验、集落形成实验观察不同浓度F951对细胞生长的影响,两种实验均显示F951可抑制兀工任刊46细胞增殖,但集落形成实验所显示的细胞增殖抑制较MI丁实验更明显,表明F951可能对肿瘤干细胞增殖具有更强的抑制作用。 将F951与化疗药物VP16联合应用于NCI一H446细胞,根据集落形成实验结果,按照协同大于相加的原理,应用welander法[6]进行效应分析,具体阐明F951与VP16联用产生的疗效提高是基于两种药物的相加效应,还是协同效应。结果显示,F951与vP16联用能?