雌激素的分泌通常呈现一种周期性,并受到昼夜节律生物钟的调控。昼夜节律生物钟由一组呈节律表达的生物钟基因及其相关蛋白产物作为核心元件组成的错综复杂的转录-翻译反馈环路,调节着生物钟基因的周期性表达,从而实现机体内部的生物节律与外部的环境变化之间的协调一致。昼夜节律运动输出周期故障(circadian locomotors output cycles kaput, CLOCK)蛋白就是该反馈环路中的核心时钟蛋白之一。越来越多的实验数据表明雌激素的周期性分泌紊乱、昼夜节律异常与乳腺癌的发生发展密切相关,但是雌激素作用的具体的分子机制还不是很明确。我们的研究通过Western blot、 Real-time PCR、荧光素酶报告基因、ChIP等方法探讨E2-ERα信号通路调控CLOCK转录的分子机制,采用MTT、克隆形成和细胞三维培养的方法研究CLOCK在乳腺癌细胞增殖中扮演的角色。我们的研究发现在ERa阳性的乳腺癌细胞系MCF-7和T47D中,E2能诱导细胞内CLOCK蛋白水平的上调,但是在ERa阴性的乳腺细胞系MCF10A和乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞内,E2对CLOCK表达无显著影响。在ERβ阴性的乳腺癌细胞系T47D中过表达ERp,对细胞内CLOCK的蛋白水平无显著影响。另外ER的拮抗剂ICI182780处理细胞能抑制E2诱导的CLOCK表达的上调作用。这些数据显示ERa能调控CLOCK的蛋白水平。为了进一步研究E2调控CLOCK蛋白水平变化的机理,我们检测了细胞中CLOCK mRNA水平的变化。研究发现E2处理能上调MCF-7细胞中CLOCK mRNA水平,ICI182780能抑制E2对CLOCK mRNA上调作用。过表达ERa和干涉ERa表达分别能增高和降低细胞内CLOCK mRNA水平。转录抑制剂放线菌素D处理能抑制E2对CLOCK mRNA的作用,但是在蛋白质翻译抑制剂放线菌酮存在的条件下,E2仍能调节CLOCK mRNA水平。以上数据说明E2/ERα对CLOCK的调控发生在转录水平。接下来我们克隆了CLOCK部分启动子至无启动子荧光素酶表达载体pGL3-basic上,构建CLOCK报告基因CLOCK-WT-Luc。 ERα以剂量依赖的方式激活CLOCK-WT-Luc表达,但是ERβ对CLOCK-WT-Luc激活作用并不显著。E2激活而ICI182780抑制CLOCK-WT-Luc表达,这提示ERα对CLOCK的调控发生在启动子水平。通过软件预测CLOCK启动子区域的雌激素受体应答元件(estrogen response elements, EREs),对预测EREs进行缺失突变和点突变,结果显示EREs位点的缺失或者是突变,均能降低CLOCK报告基因对E2或者是ERα的应答。利用ChIP实验进一步验证了ERa能以E2依赖的方式结合到CLOCK启动子区域上最后我们发现E2能促进ERα阳性乳腺癌细胞系MCF-7和T47D细胞增殖,在MCF-7中,利用shRNA的方法降低CLOCK的表达,结果抑制了乳腺癌细胞的增殖。此外,我们也利用的克隆形成和三维软琼脂细胞培养的方法检测的实验的方法,检测了在MCF-7细胞中CLOCK细胞克隆形成及锚定非依赖性生长的影响。结果显示CLOCK的表达促进乳腺癌细胞的增殖。本论文的研究将生物钟基因CLO(K的表达与E2-ERa信号联系起来,确定E2-ERa信号能正调控CLO(K的转录,CLOCK的表达促进了乳腺癌细胞的增殖。这将生物钟基因与E2-ERa信号在分子水平上的联系起来,这一研究结果有助于今后对乳腺癌的发生、发展过程的了解。