云芝产漆酶的发酵条件、分离纯化及特性研究

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漆酶(LaccaseEC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,1883年首次从漆树漆液中被发现,随后发现广泛存在于自然界中。已发现植物、真菌、昆虫以及细菌能产生这类酶,其中最重要的生产者是担子菌中的白腐菌。漆酶可催化酚类化合物和芳香胺的氧化,而且在还原介体物质存在下,漆酶的底物范围可进一步地扩大。100多年来,漆酶一直是生物学、化学和环境科学等领域十分活跃的研究热点,其中最受重视的是漆酶在木质素降解中的重要效用。随着研究的深入,漆酶在含酚废水的处理、环境中酚类毒物的降解、饮料加工、食用药用菌生产、饲料工业、医药卫生等方面的应用日渐普及。漆酶的研究涉及生物、化学、物理、医学、食品、环境等多个学科,所以对漆酶进行深入系统研究不仅具有极大的理论价值,而且也会产生巨大的社会和经济效益。本文主要从以下几个方面进行概述和研究: 1、主要概述了木质素降解酶系中漆酶的研究进展。对木质素降解微生物、酶类进行了分类说明,尤其对漆酶的生化特性、分子结构、反应机理及其分子生物学研究现状进行了系统的综述,最后对漆酶的应用进行全面阐述; 2、首先确认云芝漆酶为分泌型胞外酶,考察了产酶与生物量之间的关系,确定产酶高峰期。然后对不同的碳源、氮源、初始pH、接种量、装液量、表面活性剂、诱导剂与云芝发酵产酶量进行单因素比较,继而设计正交试验,确定最佳的发酵产酶条件,同时考察各因素主效应与产酶的显著差异。试验结果表明:葡萄糖7.5g/L、酵母粉6g/L、吐温-800.2%(V/V)、CuSO4·5H2O浓度0.05mmol/L、愈创木酚2‰(g/L)、初始pH4.5、250ml三角瓶中装液体培养基100ml时,为最佳发酵培养条件,酶活力显著提高。初始pH对产酶的影响达到极显著水平,酵母粉、吐温-80对产酶的影响均达到显著水平; 3、主要研究了云芝漆酶的分离、纯化及鉴定。首先确认粗酶液至少含有两型漆酶同工酶LacA、LacB。粗酶液在80%(NH4)2SO4盐析后,经DEAESepharoseFastFlow层析柱、Sephadex-G100柱层析两步层析,得到电泳纯组分LacA、LacB,得率分别为10.42%、13.91%,分子量分别为65KD、59KD。对两个组分利用特异反应,原子吸收光谱,蛋白质N端序列的测定进行鉴定,结果证实这两种组分应属于漆酶家族,肽指纹图谱的分析结果也支持这一结论; 4、主要研究了pH值、金属离子、温度对云芝漆酶LacA和LacB反应速率和稳定性的影响,以及酶底物的浓度效应和Km值。实验结果表明:Cu2+、Co2+对LacA和LacB有激活作用,而Ag+则有抑制作用;LacA、LacB反应最适pH为4.0和4.8,LacA在pH3.6~4.8,LacB在pH4.0~5.2表现较好的稳定性;LacA和LacB的最适反应温度分别为50℃和40℃;LacA和LacB的Km值分别为0.32×10-3mol/L、0.139×10-3mol/L;5、主要是云芝漆酶与纤维素酶、木聚糖酶的协同作用对提高木质纤维素利用效率的研究,及云芝发酵粗酶液、漆酶LacA和LacB对不同分子结构类型的多种染料脱色的探讨。漆酶的应用提高木质纤维素降解率,发酵粗酶液具有广谱脱色作用,尤其对孔雀石绿、RB亮蓝的脱色率都超过了85%,脱色较为彻底。漆酶LacA和LacB对三苯甲烷类染料亮绿、孔雀石绿脱色率都超过了90%,而两种漆酶之间在脱色程度上表现出一定的差异。
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