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仔猪早期断奶应激综合症是生猪规模化养殖中的一个重要事件,每年给养殖企业造成了巨大的经济损失。早期断奶能够导致仔猪肠道绒毛发生萎缩,引起消化吸收不良,引发炎症,进而诱导活性氧自由基的大量释放;最终导致肠道功能异常和肠道疾病发生。本课题组前期研究发现,断奶仔猪肠上皮细胞抗氧化能力随着分化而逐渐降低;而蛋白质组学分析揭示了隐窝-绒毛轴的差异蛋白主要表现在参与碳代谢、氨基酸和蛋白质代谢和氧化磷酸化等;表明能量代谢在小肠细胞的更新过程中发挥了重要作用。为了探究早期断奶仔猪肠道上皮隐窝-绒毛轴更新的分子机制,本研究以哺乳期21日龄(断奶0天)及断奶后第1、3、7和14天的仔猪空肠上皮绒毛顶端细胞(F1)和隐窝区域细胞(F3)为实验材料进行转录组和sRNA测序分析,获得相应的mRNA和miRNA表达数据。具体研究结果如下:(1)以21日龄哺乳仔猪F1为对照组,对断奶后不同日龄(1,3,7和14天)的F1进行转录组测序,分别检测到31、77、154和112个差异基因;GO和KEGG分析显示,差异表达基因的功能主要集中在代谢、刺激反应和免疫等生物学过程,并富集到激素合成、免疫缺陷、花生四烯酸代谢及信号转导等相关通路中。进一步筛选发现,脑-肠肽(GHRL、GIP、SS、GLG和MTL)、Slc39a4、CYCS和RPS19等基因表达持续下调;而PLA2、PGFS、GST、NQO1、CYP1A1、CES和IFITM1等基因表达持续上调;其中,磷脂代谢关键酶——PLA2在断奶后第3和7天显著升高且差异表达值最大(P<0.01),暗示断奶应激可能诱导了F1细胞膜的磷脂代谢。(2)断奶不同日龄F1的sRNA测序共鉴定出246个已知miRNAs以及获得119个新miRNAs,各日龄分别检测到78、108、131和161个差异已知miRNA。其中,let-7d-3p在断奶后第一周持续高表达;而miR-100表达则显著降低。对所有差异miRNA进行靶基因预测和KEGG通路分析,靶基因主要富集到Notch信号通路、甘油酯/甘油磷脂代谢、蛋白消化吸收、维生素消化吸收和脂肪酸代谢等生物学过程。(3)以21日龄哺乳仔猪F3为对照组,对断奶后不同日龄(1,3,7和14天)的F3进行转录组测序;分别检测到32、70、189和102个差异基因;GO和KEGG分析显示,差异表达基因功能主要集中在代谢、发育和刺激反应等生物学过程,并富集到激素合成、能量代谢、免疫缺陷及外源性化合物代谢等相关通路中。进一步筛选发现,脑-肠肽(GHRL、GIP、GLG和MTL)、Slc39a4、TFF3和CLCA1等基因表达持续下调;而营养物质转运载体(Slc5a12、Slc3al、Slc15al和Slc2a2)、PLA2、PGFS、CYP1A1、TRIM5和IL-18等基因表达持续上调。(4)断奶不同日龄空肠F3的sRNA测序共鉴定出220个已知miRNAs以及获得95个新miRNAs,分别检测到62、69、89和115个差异已知miRNA。其中,miR-9在断奶后第一周持续高表达;而miR-122在断奶后第1天显著降低,随后从断奶第3天开始表达量持续上调(第3-14天)。对所有差异miRNA进行靶基因预测和KEGG通路分析,靶基因主要富集到Notch信号通路、基底细胞癌、磷酸肌醇代谢、甘油酯/甘油磷脂代谢、黏着斑、碱基切除修复和氨基酸代谢等生物学过程中。(5)21日龄哺乳仔猪空肠F1和F3中sRNA测序结果表明,与F1相比,F3中有15种显著上调和41种显著下调的miRNAs;其中,miR-100表达显著性降低,且表达差异倍数最大;qRT-PCR验证miR-100在F1中的表达量显著高于F3(P<0.01)。在IPEC-J2细胞中转染miR-100 mimics能够显著增加细胞ALP含量(P<0.05);miR-100通过诱导细胞周期G0/G1期阻滞而抑制细胞增殖;细胞划痕实验证明miR-100能够抑制肠道细胞迁移;miR-100还可以通过caspase-3依赖性和Bcl-2途径诱导IPEC-J2细胞凋亡。生物信息学结合双荧光素酶报告基因验证FGFR3为miR-100的靶标;并证实在IPEC-J2细胞中,miR-100靶向结合FGFR3 3’-UTR并抑制其表达。(6)克隆获得了猪FZD6基因cDNA(GenBank登录号:KJ808827)的ORF序列长度为2139 bp,编码具有7个跨膜结构域的712个氨基酸蛋白,且胞外N端具有富含半胱氨酸的结构域。FZD6虽然在各组织中广泛表达,但是在不同组织间也具有一定的表达差异性。FZD6蛋白在空肠绒毛部分的表达量以及分布均要显著高于隐窝区域细胞(P<0.05)。IPEC-J2细胞中靶向抑制FZD6基因表达能够显著抑制细胞增殖并促进凋亡发生;进一步研究发现抑制FZD6表达能诱导Wnt/PCP信号通路重要成员——Racl、RhoA和JNK1的表达(P<0.05)。