第一部分 肿瘤异质性驱动口腔鳞癌淋巴结转移的研究口腔鳞状细胞癌(OSCC)是世界上第六常见的恶性肿瘤,表现为不同程度的分化和淋巴结转移。虽然在OSCC的手术技术和其他治疗方面取得了很大的进展,但原发性肿瘤切除、功能性颈淋巴结清扫或放疗后的复发率仍然很高。肿瘤内异质性(ITH)是由肿瘤进展的持续突变引起的。随着肿瘤的不断发展,单个细胞和克隆在肿瘤微环境中不断争夺营养、氧气和空间。在这种选择性环境中,克隆进化并获得突变,使其得以生存和增殖,并且基本上成为显性亚克隆,而其他克隆要么消亡,要么保持沉默。基于对OSCC的全外显子测序(WES)基因组研究,我们分析了OSCC的基因组突变,特别是体细胞突变和肿瘤的进化树,表明OSCC的瘤内异质性是在不同区域的单个肿瘤间隙中进行的,并对这些不同的肿瘤片段进行分析,发现不同片段的独特性和共同拷贝数的变化。早期的研究表明,肿瘤克隆具有广泛的遗传和生物学特性。我们的结果可以进一步揭示OSCC的复杂性和异质性。这些发现可能有助于未来的临床试验发展,克服肿瘤的时空异质性,改善OSCC患者的临床治疗状况。目的:口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔癌中最常见的一种类型,但对其发生发展及转移的驱动机制研究尚不多见。在这项研究中,我们旨在探究OSCC的瘤内异质性和亚克隆突变对于淋巴结转移的驱动作用,以确定新的潜在治疗靶点。方法:为解决这个问题,我们对18例OSCC患者的86个肿瘤区域的所有外显子进行了测序。由包含测序适配器的Illumina机器读取碱基,然后移除含有五个以上未知碱基的低质量片段以获得干净的数据。这些干净的数据被映射到人类参考基因组(GRCh38)上,并使用ANNOVAR进行变异注释。用GATK4Alpha分析体细胞拷贝数的变化,然后用肿瘤和正常组织的比例覆盖进行标准化,然后进行切线标准化。最后,采用循环二值分割法对拷贝比部分进行分割。在此基础上,筛选肿瘤驱动基因,构建OSCC肿瘤进化树,分析转移特征。结果:1.口腔鳞癌的异质性。肿瘤异质性不仅存在于不同患者中,而且存在于同一患者内部。同一样本中的口腔鳞癌也显示出不同亚型。在原发性肿瘤中,染色体不稳定主要表现为三倍体甚至多倍体,单倍体较少。转移性肿大淋巴结以单倍体为主。结果表明,OSCC的原发灶和转移淋巴结中均存在异质性肿瘤细胞,包括存在于患者的血液中。这些异质性肿瘤细胞在肿瘤的发生、转移、远处的定植和肿瘤微环境的维持中发挥着重要作用。2.全外显子测序(WES)。用18例原发性OSCC患者的基因组DNA进行WES检测。共对86个肿瘤区域进行了测序,平均覆盖深度为100×。共鉴定出1,720个非沉默体细胞突变(影响1,287个基因)和433个沉默突变,验证率为90%。同时在现有OSCC测序数据的基础上,对潜在的驱动突变进行了鉴定。根据以前在其他肿瘤类型中的发现,驱动突变是肿瘤发展的相对早期的。然后,推测的驱动突变被分为致癌基因突变和肿瘤抑制基因突变。半数的亚克隆突变位于肿瘤进化树的分支上,靶基因包括TP53、MROH8、MUC4、KMT2D、DMD和NOTCH可影响肿瘤的进化和转移。这些发现表明,在考虑抑制OSCC中的这些突变体时应额外小心。3.拷贝数变异(CNA)。我们检测了单个区域体细胞突变的克隆状态。分析肿瘤细胞的局部拷贝数、VAF和纯度。计算CCF。驱动因素包括许多癌基因,包括TP53、MROH8、MUC4、KMT2D、DMD和NOTCH1,它们强调了这种亚克隆突变在OSCC形成和转移中的重要作用。例如,在OSCC95309中,在T1和T3区观察到染色体7p11.2(包括KMT2D)扩增,而在T2和T4区则没有。同样,染色体9p21.3(含有MROH8和AADACL3)的缺失在某些情况下是普遍存在的,但在其他样本中也发生了异质性像差。唯一发现普遍存在的驱动CNA是11q13的拷贝数增益,其中包括许多癌基因,如NOTCH1、MUC4和KLHL4,突出了这种畸变作为OSCC发展中的创始基因组损伤的重要性。这些结果表明,与体细胞突变相似,CNAs也显示出显著的空间ITH,与其他几种癌症的观察结果一致。体细胞突变率(每例平均=238个突变)高于每个肿瘤区域(每个区域平均=187个突变)。例如,KMT2D突变仅在20.9%的肿瘤区域(与先前的结果一致)和1.33%的病例中检测到。此外,在每个肿瘤区域检测到的亚克隆突变的比例大大低于每个病例。这些结果表明,亚克隆突变也显示出类似于体细胞突变的ITH,这一特征在其他几种癌症中是一致的。因此,单个活检的测序数据分析可能低估了突变的发生率,尤其是那些在发病后期获得的突变。4.肿瘤异质性和亚克隆突变影响口腔鳞癌进化。为了研究ITH和OSCC的基因组进化,在鉴定每个肿瘤区域的体细胞突变(沉默和非沉默)的基础上构建了一个系统发育树。每棵树的主干、“共享”分支和“私有”分支分别代表所有肿瘤区域、一些肿瘤区域(但不是所有肿瘤区域)和只有一个肿瘤区域的突变。在不同的条件下,系统发育树变化很大。所有OSCC患者均表现出空间ITH的证据,空间异质性的体细胞变异平均占60.68%(范围29.7%-97.2%)。根据大规模OSCC测序数据确定了潜在的驱动突变。总体上,树干驱动突变的富集显著高于乘客突变(77.8%对63.8%;P=0.023)。这一结果表明,驱动突变是肿瘤进化过程中相对较早的事件,与其他肿瘤类型的先前发现一致。然后,推测的驱动突变被分离为驱动突变,发生在癌基因或肿瘤抑制基因。值得注意的是,一半定位于分支的驱动突变(50.0%)位于癌基因中,包括TP53、MROH8、MUC4、KMT2D、DMD和NOTCH。潜在可操作的突变,如针对PRUNE2和CASP8的突变,往往是致癌的分支事件。例如,5例中有18例存在KMT2D突变,在所有突变病例中均位于分支的近端。5.亚克隆突变在肿瘤转移中的作用。通过突变谱分析,我们可以知道每个肿瘤样本中各种类型突变的数量(如C>T/G>A),以及样本是否偏好某种类型的突变。通过分析体细胞突变的特征,可以研究不同癌症物种的体细胞点突变特征。在几个突变频率高的亚克隆突变中,沉默突变占最大比例。在86个样本中,高频突变基因之间可能存在协同或相互排斥的关系。协同效应表明,这两个基因可能必须同时突变,以产生致癌作用。互斥效应表明,如果单独突变,这两个基因可能是致癌的。例如,TP53协同和相互排斥的基因可以作为进一步研究OSCC进展和耐药性的靶点。肿瘤中大多数亚克隆突变富集途径与肿瘤的进展和转移有关,如Hippo信号通路、p53信号通路和凋亡通路。这些结果表明,亚克隆突变通过驱动肿瘤相关通路促进口腔鳞癌转移。6.突变谱和特征的时间解剖。为了确定OSCC突变的时间动态,利用解构图和签名分析树干和分支的突变。计算单个突变信号对每个肿瘤的贡献,并确定了所检查的肿瘤中的几个特征。推断的签名包括签名1(与年龄相关)、签名2和13(与APOBEC相关)、签名6和15(与DNA错配修复相关)、签名3(与DNA双链断裂修复相关)和签名7(与鳞状细胞癌的紫外线暴露相关)。在某些情况下,分支突变(如OSCC95309和OSCC94377)中观察到与DNA错配修复(包括特征6和20)和微卫星不稳定肿瘤(包括特征21)相关的特征的贡献增加。数据表明,在OSCC的进展中,各种突变过程可能在亚克隆多样性中发挥重要作用。结论:口腔鳞癌的肿瘤异质性和亚克隆突变主要发生在肿瘤抑制基因中,抑癌基因TP53、MROH8、MUC4、KMT2D、DMD和NOTCH等频繁地被驱动,与肿瘤发生和转移信号通路有关。我们对ITH和亚克隆突变的研究为进一步了解OSCC的发生和转移提供了重要的分子基础,为治疗本病提供了潜在的靶点。第二部分EprinA3信号介导的EMT调控口腔鳞癌转移的机制口腔癌是一种侵袭性较强的肿瘤,约90%以上为鳞状细胞癌。尽管在癌症的诊断和治疗方面取得了进展,但口腔鳞状细胞癌的5年生存率仍是所有口腔癌中最低的。上皮-间充质转换(EMT)是上皮细胞失去形态并获得间充质细胞形态特征的过程,对肿瘤转移具有重要意义。EMT标记物在OSCC患者的侵袭前表达,提示这一现象发生在肿瘤的进展过程中。因此,EMT对OSCC的预后有一定影响。OSCC中的EMT可归因于几种致癌途径,包括转化生长因子-β(TGF-β)/Smad通路、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路、Notch通路和Wnt通路。我们前期研究表明,EphA2和EphrinA1在口腔鳞癌和唾液腺腺样囊性癌中过度表达。EphrinA3在胚胎神经系统生长发育中起着重要作用,但其在肿瘤发生和进展中的作用尚不清楚。目的:本研究旨在探讨EprinA3信号介导上皮-间质转化(EMT)在OSCC转移调控中的作用,为OSCC寻找新的治疗靶点。方法:2013年至2015年,我们收集了武汉大学口腔医院口腔颌面部头颈肿瘤外科53例口腔鳞癌患者的原发性肿瘤样本,并选择邻近的正常粘膜作为阴性对照。制备组织芯片,进行EphrinA3和E-cadherin染色评估并观察其相关性。使用CAL-27和SCC25这两个细胞系进行体外实验来研究EphrinA3信号与上皮-间质转化(EMT)的关系及主要信号通路的关系。最后,我们在裸鼠身上进行了荷瘤实验,以验证EprinA3信号对口腔鳞状细胞癌(OSCC)发生体内转移的调控机制。结果:1.口腔鳞癌中的EphrinA3与E-Cadherin表达呈负相关。我们测定了组织中EphrinA3和E-Cadherin染料的平均光密度值,发现EphrinA3不仅与E-cadherin表达呈负相关,而且与病理分级呈负相关,换句话说,在高级别肿瘤中,EphrinA3的表达降低。这一差异在Ⅰ级和Ⅱ级之间以及Ⅰ级和Ⅲ级之间有统计学意义(p<0.01),但在Ⅱ级(p=0.357)之间无统计学意义。2.蛋白质谱分析显示EphrinA3与肿瘤进展有关。我们从过表达EphrinA3和转染vector组的CAL-27细胞中提取总蛋白,并用蛋白质组学方法对差异表达的蛋白进行定量分析。使用智人数据库命名差异表达蛋白,使用MASCOT2.6进行数据库检索。等压标记物用于相对和绝对定量,以定量化差异表达的蛋白质。总的来说,共有24种差异表达蛋白符合筛选标准,其中17个上调,7个下调。利用GO注释的富集分析,我们发现这些差异蛋白的一些生物学行为与肿瘤进展有关。3.EphrinA3介导了口腔鳞癌中的EMT。在24小时间隔内,EphrinA3-RNAi组的Cal-27和SCC-25细胞(代表敲除EFNA3基因的病毒转移后构建的SCC25和Cal-27细胞系)的划痕愈合能力比EphrinA3-mimics组(代表过表达蛋白EphrinA3的SCC25和Cal-27细胞系)组强。在12小时内,EphrinA3基因敲除组的Cal-27和SCC-25 细胞的侵袭能力强于 EphrinA3 基因高表达组。经 PTX(紫杉醇)处理后,转染Ephrin A3-RNAi病毒组的细胞凋亡率低于阴性对照组,而Ephrin A3-mimics病毒组的凋亡率高于阴性对照组。在EphrinA3基因敲除组中,Cal-27和SCC-25细胞的增殖能力强于EphrinA3过表达组。4.EphrinA3信号通过PI3K/AKT通路调控EMT。EphrinA3表达的降低可导致E-Cadherin表达的降低、N-Cadherin表达的升高,同时p-AKT(Ser473)表达也升高,表明PI3K/Akt通路被激活。应用EphrinA3-mimics后,E-cadherin过度表达,N-cadherin表达下降,同时p-AKT的表达也下降,表明PI3K/Akt通路受到抑制。5.抑制Ephrin A3的表达可促进体内肿瘤的增殖。Ephrin A3-RNAi组肿瘤体积大于以EphrinA3-mimics组(P<0.05)。用Western Blot对总蛋白进行分析,在体外实验中也发现了相同的趋势。因此,EphrinA3的敲除可促进肿瘤增殖,而EphrinA3的过度表达可能抑制肿瘤的增殖。6.MiR-210-3p靶向基因EFNA3调控肿瘤进展。我们利用三个数据库预测了四个靶向基因EFNA3的micro RNAs,验证了miR-210-3p在SCC-25和Cal-27细胞系中的表达。采用双荧光素酶检测法,进一步证实MIR-210-3p的目标基因是EFNA3。在SCC-25和Cal-27细胞中转染miR-210-3p后,实时PCR显示随着miR-210-3p表达的增加,EphrinA3的表达降低。然而,miR-210-3p表达的降低也增加了 EphrinA3的表达。因此,通过PI3K/AKT信号通路介导EFNA3基因的miR-210-3p可以调节口腔鳞癌细胞的EMT进程。结论:在口腔鳞癌中,miR-210-3p/EphrinA3/PI3K/ATK生物信号轴起着重要作用。通过该途径下调EphrinA3表达,可抑制口腔癌上皮间充质转化过程,进一步抑制口腔鳞癌的发生和转移。因此,EphrinA3可能成为口腔鳞癌治疗的新靶点。