中枢神经系统(CentralNervousSystem，CNS)感染性疾病是由多种病原体引起的严重威胁人类生命健康的病症，该种类型的疾病发病急，诊断困难，致死率高，这就要求对脑脊液中病原体进行快速准确的检测鉴定，以期早期采取有效的针对性治疗措施。由于不同的病原体感染，病变范围、程度相差悬殊，临床表现十分复杂，给诊断带来困难，确诊的主要依据是脑脊液的病原学诊断，长期以来病原体诊断主要依靠形态学检查、脑脊液细菌培养及组织学的方法，但脑脊液中病毒含量甚低，其病毒培养检测不但费时、费力，且敏感性和特异性差，远远不能满足临床要求，造成该类疾病的死亡率居高不下或病后严重的后遗症。为解决这一难题，多年来该领域的工作者在细菌学、免疫学、分子生物学以及微生物学等领域做了大量的工作，建立了许多新的病原体诊断技术。 以PCR技术为基础的各种分子生物学诊断技术，成为生物医学领域内最有价值的研究手段和病毒学诊断的金标准，已经广泛应用于临床标本的检测，为该类疾病的基因诊断带来了突破性进展，为从基因水平诊断脑脊液病原体奠定了基础。但PCR的方法虽然敏感性高，可同时检测多种病原体的数量有限。而生物芯片技术的发展则提供了一种解决这一问题的途径，本研究拟构建平行检测中枢神经系统感染的常见病原体的寡核苷酸芯片，并对其临床标本的检测进行应用评价。 研究目的： 以醛基化玻片为基片，构建一种用于检测巨细胞病毒(CMV)、风疹病毒(RV)、单纯疱疹病毒I型(HSVI)、结核分枝杆菌(TB)、EB病毒(EBV)五种常见病原体的寡核苷酸芯片，用于中枢神经系统疾病的主要病原体的病因学诊断，为临床治疗提供病因学依据。 研究方法： 1.根据病原体的特异性蛋白的相关序列设计五种病原体70mer寡核苷酸长探针，每种病原体设计两条探针。 2.优化70mer探针的芯片的点样浓度、点样后的固定方法，探索比较两种靶基因标记方法，并优化适合长探针的杂交液及各种杂交条件。 3.在优化的条件基础上，选择特异性好的探针构建不同种属多种病原体的寡核苷酸芯片，设计五种病原体的长探针寡核苷酸芯片。 4.用随机引物方法对靶基因进行生物素掺入标记，标记产物与芯片杂交后再与avidin-Cy3反应，对杂交阵列洗涤后扫描。 5.芯片的重复性和稳定性实验。 6.采用该寡核苷酸芯片对临床样本进行检测并与和PCR检测方法进行比较。 研究结果： 1.选择病原体具有特异抗原决定簇的蛋白编码序列设计得到70mer左右的长片断探针，通过标准菌株检测证明该检测芯片具有很好的特异性。 2.标记策略上我们比较了两种方法，发现对样品采用随机引物间接标记的方法，先掺入生物素，杂交后再与avidin-Cy3反应，这种方法较Cy3直接标记信号强度强，成本相对更低廉。 3.通过实验优化制备病原体长探针寡核苷酸芯片的制备方法，样品标记策略和杂交液及杂交温度，实验证明点样浓度在10μmol/L时就可获得满意的荧光强度。探针点样后37℃水合，在3600mJ条件下进行紫外交联固定效果最好。优化出的杂交液成分：50％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS，杂交时间为2h，杂交温度为65℃。这些条件为下一步制备多种病原体的寡核苷酸芯片检测系统奠定了基础。 4.以优化的条件制备的寡核苷酸芯片对临床标本的检测结果表明，制备的寡核苷酸芯片检测体系与PCR法的检测结果相比，两种检测方法没有显著性差异(p＞0.05)，且一致性较好(Kappa值均大于0.75)，可以获得理想的检测效果。 研究结论： 1.70mer寡核苷酸探针具有更好的特异性，本实验通过采用70mer的探针明显的提高芯片的稳定性和可重复性。 2.优化的五种病原体同时标记的策略为，采用随机引物掺入的方法将biotin掺入到待测序列中，标记产物与芯片杂交后，再与avidin-Cy3反应结合，能明显的起到放大检测信号的效果，使芯片具有更高的灵敏度。 3.本实验通过优化实验条件构建的五种病原体平行检测寡核苷酸芯片技术体系具有检测相对快速、方便、准确，可以高通量的检测临床样本而无须进行细菌培养，为中枢神经系统感染的病原体学检测提供了一种更有效方法。