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研究背景与目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylor,H.pylori）感染是慢性胃炎、消化性溃疡和胃粘膜相关淋巴组织（Mucosal-associated lymphoid tissue,MALT）淋巴瘤的主要致病因子,并且与胃癌的发生密切相关,被国际癌症机构和世界卫生组织定为一类致癌原。因此有效根除H.pylori对防治上述疾病具有重要临床意义。目前临床常用的根除幽门螺杆菌的抗生素包括甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四环素和呋喃唑酮等。质子泵抑制剂（PPI）加两种抗生素的三联疗法或再加铋剂的四联疗法是临床最常用的治疗方案。近年来,随着抗生素的广泛使用,H.pylori抗生素耐药问题越来越突出,尤其是对甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星耐药率不断增加,并出现了双重和多重耐药（multidrug resistance,MDR）株,导致H.pylori根除率下降,严重影响了H.pylori相关性疾病的防治。因此,明确H.pylori的耐药的机制,对寻找有效的H.pylori根除方案极为重要。特异性耐药基因突变和外排泵的高表达是细菌产生耐药的主要机制,甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星的特异性耐药基因分别是rdxA基因、23S rRNA基因和gyrA基因。RND家族中的AcrAB-TolC外排泵主要存在革兰阴性菌中,并在H.pylori耐药中起着重要作用。外排泵表达和功能的变化与药物特异性靶基因的突变共同导致细菌的继发性耐药。基于以上研究现状,为了深入探究外排泵的变化与药物特异性靶基因的突变之间的关系,本文检测了H.pylori不同耐药菌株AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因hefA、hefD和hefG的mRNA表达和相对应抗生素特异性耐药基因的突变情况;并进一步检测了克拉霉素诱导H.pylori耐药过程中,AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因hefA、hefD和hefG的mRNA表达和克拉霉素特异性耐药基因的突变;最后检测了外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙（carbonyl-cyanidem-chlorophenylhydrazone,CCCP）对外排泵的抑制作用及对H.pylori耐药的影响。方法:1.H.pylori菌株选择:在本实验室保存的600株H.pylori临床分离株中筛选出8株对8种抗生素甲硝唑（MZ）、克拉霉素（CH）、阿奇霉素（AZ）、左氧氟沙星（LE）、莫西沙星（MX）、阿莫西林（AM）、四环素（TC）、利福平（RI）全敏感菌株（敏感组）、5株对咪唑类、大环内酯类和喹诺酮抗菌药物均耐药的多重耐药菌株（多耐药组）、6株单一甲硝唑耐药菌株（甲硝唑组）、2株单一克拉霉素耐药菌株（克拉霉素组）、5株单一左氧氟沙星耐药菌株（左氧氟沙星组）,对菌株进行复苏、培养、鉴定。2.H.pylori对抗生素敏感性检测:采用E-test的方法检测抗生素对H.pylori的最低抑菌浓度（MIC）,H.pylori国际标准菌株ATCC43504为质控,依照美国临床实验室标准委员会（NCCLS）的标准判定细菌为耐药或敏感:对于甲硝唑,MIC≥8μg/ml判定为耐药;对于克拉霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、阿莫西林、四环素、利福平,MIC ≥ 1 μg/ml判定为耐药。3.H.pylori菌株中AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因hefA、hefD和hefG的mRNA的检测:采用RT-PCR方法,以16S rRNA为内参基因。4.H.pylori菌株相对应抗生素特异性耐药基因的突变检测:提取基因组DNA,PCR扩增后进行DNA测序。将测序结果运用DNAMAN软件进行分析,以H.pylori26695标准菌株序列作对照进行序列比对。5.利用克拉霉素体外诱导H.pylori耐药:选取6株对8种抗菌药物全敏感株菌,分别为S5a、S12a、S28a、S39a、S59a、S96a,通过液态培养方法,首先加入敏感菌株MIC的1/2倍克拉霉素浓度,然后浓度逐渐二倍递增,即1/2×MIC,以后逐渐往高浓度诱导1×MIC、2×MIC……256×MIC甚至更高,每一步均检测MIC、外排泵相关蛋白编码基因hefA、hefD和hefG的表达及23S rRNA基因的突变。6.外排泵抑制剂CCCP对H.pylori菌株的影响:不同浓度CCCP作用H.pylori标准菌株ATCC43504和克拉霉素诱导耐药菌株S 12a-2×MIC后检测外排泵基因的表达;同一浓度CCCP作用H.pylori标准菌株ATCC43504和克拉霉素诱导耐药的菌株S12a-2×MIC后在不同时间点（0h、3h、6h…48h）检测外排泵基因的表达情况;检测外排泵抑制剂CCCP对抗生素MIC的影响:加入CCCP抑制剂后抗生素对H.pylori的MICs变化为原来的1/4甚至更低,被认为有差异。结果:1.E-test方法确认和验证了所选菌株是所需要的菌株,包括8株对8种抗生素全敏感的菌株、5株多重耐药菌株、6株单一甲硝唑耐药菌株、2株单一克拉霉素耐药菌株和5株单一左氧氟沙星耐药菌株。2.临床分离的不同H.pylori菌株中AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因hefA、hefD和hefG的mRNA表达情况:hefA、hefD mRNA在多重耐药组的表达显著高于敏感组、单一甲硝唑耐药组、单一克拉霉素耐药组和单一左氧氟沙星耐药组（P0.05）;hefG mRNA在多重耐药组的表达虽高于敏感株组、单一甲硝唑耐药组、单一克拉霉素耐药组、单一左氧氟沙星耐药组,但差异没有统计学意义（P>0.05）;各个单一耐药组及敏感株组相互比较,hefG mRNA在各组中的相对表达量虽有差异,但差异没有统计学意义（P>0.05）。综合上述结果,多耐药H.pylori菌株AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因mRNA高表达,而单一抗菌药物耐药菌株中该基因无明显高表达。3.特异性耐药基因的突变情况:5株多重耐药菌株中均存在rdxA基因突变,突变位点比较分散;也都存在gyrA基因突变,主要突变位点为T260C、C302T和T308C;5株多重耐药菌株和2株单克拉霉素耐药菌株均存在23S rRNA基因突变,主要突变位点为A2143G;个别菌株突变位点为G2212A。综合上述结果,多重耐药、克拉霉素单一耐药H.pylori菌株均存在相应的特异性耐药基因突变。4.克拉霉素诱导H.pylori耐药过程中AcrAB-TolC外排泵基因的表达及相应特异性耐药基因突变情况:综合分析6株敏感H.pylori菌株在克拉霉素诱导耐药过程中的变化得出以下结果:未经克拉霉素诱导的菌株经同样传代后外排泵相关蛋白编码基因持续低表达,也无特异性耐药基因的突变。经克拉霉素诱导后,所有菌株在2×MIC浓度内均产生了耐药,其中1株菌在2×MIC浓度、2株菌在1×MIC浓度、3株菌在1/2×MIC浓度时产生耐药;这其中在2×MIC浓度时产生耐药的S5a菌株耐药发生在外排泵基因高表达和特异性耐药基因突变之前,其余5株菌产生耐药时均分别有外排泵基因高表达或特异性耐药基因突变;这5株菌中3株（S28a、S39a、S96a）在1/2×MIC浓度时产生耐药的H.pylori菌株外排泵基因的高表达均发生在特异性耐药基因突变之前,尤其是hefG基因。仅在外排泵基因高表达时,H.pylori对克拉霉素的耐药强度较低;特异性耐药基因突变位点虽有不同,但已稳定存在时,此时的MIC均已大于64 μg/ml。在诱导过程中外排泵基因的表达会有所波动,特别是当特异性耐药基因出现突变后,外排泵基因的高表达对H.pylori耐药的维持就不再重要。5.外排泵抑制剂CCCP对H.pylori菌株的影响:①CCCP对外排泵基因表达抑制作用所需的浓度和最佳作用时间在对抗菌药物敏感的H.pylori标准菌株ATCC43504和克拉霉素诱导产生耐药的S12a-2×MIC菌株中均不同:在ATCC43504菌株中,CCCP浓度达0.6 μg/ml才可显著抑制外排泵基因的表达（P<0.05）,其最佳作用时间是9-24h;而在克拉霉素诱导产生耐药的S12a-2×MIC菌株中,CCCP浓度达0.04 μg/ml时就可显著抑制外排泵基因表达（P<0.05）,其最佳作用时间是3-15h。②外排泵抑制剂CCCP作用后,5株MDR菌中有3株菌甲硝唑的MIC变化为原来的1/4甚至更低,有2株菌克拉霉素的MIC变化为原来的1/4甚至更低,有2株菌左氧氟沙星的MIC变化为原来的1/4甚至更低。在敏感菌株中,CCCP对抗生素的MIC影响不明显。结论:1.临床分离的H.pylori克拉霉素单一耐药菌株均存在相应的特异性耐药基因突变,外排泵基因表达和敏感株组相比无显著差异,但在克拉霉素诱导H.pylori耐药过程中部分菌株外排泵基因呈高表达,并发生于特异性耐药基因突变产生之前,而特异性耐药基因突变后外排泵基因表达可回落。提示:外排泵可能在H.pylori产生耐药的早期高表达,对抗生素治疗环境中的H.pylori产生适应性保护,使H.pylori有时间产生特异性耐药基因突变。当突变发生后,外排泵基因高表达对H.pylori耐药的维持就不再重要。2.AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因hefA和hefD在临床分离的H.pylori MDR株中的表达高于敏感菌株和单一耐药菌株,且外排泵抑制剂能降低部分抗生素对H.pylori MDR株的MIC,提示AcrAB-TolC外排泵是导致H.pylori多重耐药的重要原因之一。且所有H.pylori MDR株的耐药情况与特异性耐药基因突变的情况相符合,提示AcrAB-TolC外排泵与特异性耐药突变共同介导了H.pylori MDR的多重耐药。