登革病毒(DENV)属于黄病毒科黄病毒属,包括四个血清型,以伊蚊为主要传播媒介,可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征。登革病毒感染是当今世界上分布最广的一种虫媒病毒病。据WHO估计,全球有25-30亿人口面临感染登革病毒的危险,每年因登革病毒感染死亡的人数约为2.5万。目前,登革病毒的感染机制仍不明确,并且由于各血清型之间缺乏有效交叉保护,存在抗体依赖增强作用,至今尚无安全有效的疫苗推广应用。病毒样颗粒(VLPs)疫苗是近年来发展起来的一种新型亚单位疫苗,目前己应用于一些病毒性疾病的预防控制中,也为登革疫苗的研究提供了新的思路。VLPs具有与天然病毒颗粒相同或相似的结构而没有病毒核酸,不能自主复制,没有毒力回复的可能,因此具有较好的免疫原性和安全性,是一种很好的登革疫苗候选物。登革病毒为单股正链RNA病毒,基因组长约11kb,含有一条单一开放读码框。编码3个结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。其中E基因编码的E蛋白是病毒的主要包膜糖蛋白,可以诱导产生中和抗体,是登革病毒的主要保护性抗原。prM基因编码的prM蛋白为膜蛋白M的前体,是病毒诱发保护性免疫的重要协同成分,此外还有助于E蛋白的正确折叠及其结构的稳定。对于黄病毒属成员而言,共表达prM蛋白和E蛋白可形成病毒样颗粒。本研究的主要目的是用prM基因和E基因构建四个型别登革病毒的病毒样颗粒,并初步研究其免疫原性,为研制四价登革病毒样颗粒疫苗奠定基础。由于天然登革病毒颗粒通过细胞分泌途径被运送至胞外,而真核表达系统具有准确的转录、翻译后加工修饰功能及跨膜转运机制,有利于VLPs的正确组装,其表达的蛋白质更接近天然病毒抗原,具有较为完整的生物学功能。因此,本研究选择哺乳动物细胞表达系统及杆状病毒-昆虫细胞表达系统来进行登革病毒样颗粒的分泌表达研究。我们首先对登革病毒的prM-E基因进行特性分析及分泌表达设计,并通过融合PCR方法对表达元件进行改造,包括：1)在登革病毒prM基因前添加一段来源于乙型脑炎病毒(JEV)的信号肽序列(JESS); 2)将1-4型登革病毒E基因3’端20%区域缺失或替换为JEV E基因的相应部分。我们将改造后的相应基因元件分别克隆至哺乳动物细胞表达载体pcDNA5/FRT及杆状病毒昆虫细胞表达载体pAcUW51-M、PAcGP67-B及pAcSecG2T中,构建了一系列经酶切鉴定及序列测定均正确的登革病毒样颗粒重组表达质粒。为了研究上述重组表达载体分泌表达登革病毒样颗粒的能力,我们将其转染293T细胞或Sf9细胞,并通过间接免疫荧光、Western blot方法检测登革VLPs在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的表达与分泌情况。结果显示,所有重组载体转染相应细胞后,prM-E蛋白在细胞内均得到有效的表达。同时,在哺乳动物细胞表达系统中,我们实现了全部四个型别登革病毒样颗粒的分泌表达,而在昆虫细胞表达系统中,仅有携带乙脑信号肽的DENV-1 prME克隆至pAcUW51-M载体后,染毒上清中隐约可见目的条带,其他质粒转染Sf9细胞的染毒上清中均未检测到目的蛋白的分泌表达。因此,我们选择哺乳动物细胞作为登革病毒样颗粒的表达系统,并最终确定PJD1prME、pJD2-D4prMEA20%JEV作为1-4型登革病毒样粒的重组表达载体。在上述研究基础上,我们分别将pJD1prME、pJD2-D4prME△20%JEV大量瞬时转染293T细胞进行1-4型登革病毒样颗粒的大量制备,转染上清经蔗糖密度梯度离心纯化后,在电镜下可观察到类似天然登革病毒颗粒的结构。最后,我们对单价及四价登革病毒样颗粒的免疫原性进行研究。结果显示登革1、2、3、4型VLPs具有良好的免疫原性,单价及四价等量配伍免疫时均能刺激小鼠产生抗登革rEⅢ蛋白的特异性IgG抗体,间接免疫荧光检测显示小鼠免疫血清能与表达1-4型登革病毒prM-E蛋白的Sf9细胞起阳性反应。中和试验测定显示单价免疫时,四个型别登革病毒样颗粒能刺激小鼠产生针对同型病毒的中和抗体,中和效价最高可达1：20,四价等量配伍免疫时,可刺激小鼠产生针对全部四个型别登革病毒的中和抗体。此外,单价及四价登革VLPs均可刺激一定水平的细胞免疫应答。综上所述,本研究成功构建了1-4型登革病毒样颗粒的重组表达载体,并利用哺乳动物细胞表达系统实现了全部四个型别登革VLPs的分泌表达,在透射电镜下观察到了形态结构类似天然登革病毒的颗粒。在此基础上对单价及四价登革病毒样颗粒的免疫原性进行研究,结果显示本研究所构建的病毒样颗粒能刺激BALB/c小鼠产生登革特异性体液免疫和细胞免疫应答。以上结果为登革病毒样颗粒疫苗的研究奠定了良好基础,也为研究登革病毒新型疫苗进行了有益的探索。随着研究的深入,可对prM-E基因表达元件进行进一步优化,以提高登革病毒样颗粒的表达量,也可改善免疫策略,以获得更好的免疫效果。同时登革病毒样颗粒也可作为诊断抗原应用于登革热血清学诊断中。