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研究目的脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemic reperfusion injury,CIRI）的病理生理学机制复杂。脑缺血再灌注损伤中枢抑制微环境,Rho A/ROCK介导的神经再生抑制通路及神经可塑性蛋白关系密切,是研究的热点之一。本论文探讨电针百会、足三里对脑缺血再灌注损伤大鼠中枢抑制微环境、Rho A/ROCK神经再生通路和神经可塑性蛋白的影响,为缺血性脑卒中的临床治疗提供实验依据。实验方法将健康雄性SD大鼠随机分成模型组、假手术组、电针组和法舒地尔（ROCK激酶抑制剂）组,本实验共用大鼠75只,分批次造模,造模成功64只,每组16只。假手术组仅分离右侧颈总、颈内和颈外动脉,不插入线栓;模型组以线栓法制备CIRI大鼠模型,大鼠大脑中动脉闭塞2h,再灌注7d。电针组造模成功后取百会和左侧足三里穴,连接脉冲电疗仪,每日1次,每日20min,连续7d。法舒地尔组造模成功后,每日腹腔注射盐酸法舒地尔（15mg/kg）,每日1次,连续7d。假手术组和模型组大鼠仅每日抓取刺激一次,不做任何干预。电针组和法舒地尔组首次干预时间均在拔除线栓后进行。采用TTC染色计算脑梗死体积,Garcia JH神经功能评分对大鼠进行神经行为学评价,采用透射电镜观察大鼠海马神经元形态学变化。通过免疫电泳、免疫荧光、实时荧光定量PCR法检测中枢微环境中髓鞘相关抑制因子（Nogo-A、MAG、OMgp、NgR）,Rho A/ROCK 通路相关分子（Rho A、ROCK2、MLC1、MYPT1）及神经可塑性相关蛋白（GAP-43、BDNF、Synaptophysin）的表达。验证电针百会、足三里可以通过下调髓鞘相关抑制因子诱导的Rho A/ROCK神经再生抑制通路,促进神经可塑性相关蛋白的表达,减缓脑缺血再灌注损伤的科学假说。实验结果1.电针百会、足三里可改善CIRI大鼠的脑梗死体积和神经行为学TTC染色结果显示模型组大鼠脑梗死体积显著大于假手术组（P<0.001）,电针组和法舒地尔组大鼠脑梗死体积显著小于模型组（P<0.01）。此外,Garcia JH评分从自主运动、体态的对称性、前肢伸展运动、攀爬和抓持铁笼的能力、两侧身体触觉反射、两侧胡须触觉反射六个方面进行神经功能评估,分数越低,损伤越大。本研究显示,与假手术组相比,模型组评分明显下降（P<0.001）,而电针或法舒地尔干预可显著提高评分（P<0.01）。电针组与法舒地尔组间的脑梗死体积和神经功能评分无统计学差异。2.电针百会、足三里可改善CIRI大鼠海马神经元的超微结构假手术组大鼠海马神经元细胞膜清晰完整;细胞核体积大而圆润,以常染色质为主;线粒体分布均匀,膜清晰;粗面内质网轻度扩张,表面核糖体附着。而模型组细胞核不规则,边缘呈锯齿状;线粒体严重肿胀、基质电子密度下降,膜清晰,嵴扩张、变短,个别外膜崩解;粗面内质网中度扩张,表面核糖体局部脱落。电针组细胞膜清晰、完整,细胞核体积大而圆润;线粒体嵴扩张、断裂、变短;粗面内质网轻度扩张,部分表面核糖体脱落;胞内含少量脂褐素。法舒地尔组细胞核体积大而圆润;线粒体分布均匀,局部空泡化,嵴扩张、变短、少量缺失,近半数线粒体膜破损;粗面内质网轻度扩张,表面核糖体附着。3.电针百会、足三里可通过减轻CIRI大鼠髓鞘相关抑制因子（MAIs）及受体NgR的表达改善中枢微环境Nogo A、MAG和OMgp是存在于中枢神经系统的主要MAIs。①western blot显示:与假手术组比较,模型组Nogo A表达明显升高（P<0.001）,OMgp、MAG、NgR表达有升高趋势,但无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较,电针组OMgp、Nogo A和NgR水平均显著下调（P<0.05）。②免疫荧光显示:与假手术组比较,模型组半暗带区的Nogo A、MAG表达显著升高（P<0.01）,电针干预可显著减少Nogo A表达（P<0.05）,电针组MAG表达较模型组升高,但是无统计学意义（P>0.05）。③q-PCR显示:与假手术组相比,模型组MAG、OMgp、NgR的mRNA水平呈上升趋势,但无统计学意义（P>0.05）,电针干预可显著降低NgR的mRNA水平（P<0.05）,与模型组比较,电针组的MAG、OMgp、Nogo A的mRNA水平下调,但是无统计学意义（P>0.05）。4.电针百会、足三里可减缓CIRI大鼠脑组织RhoA/ROCK介导的神经再生抑制通路的表达Rho A/ROCK信号通路介导抑制性信号,是阻断中枢神经再生的重要途径。①western blot显示:与假手术组相比,模型组ROCK2和MYPT1表达明显增加（P<0.05,P<0.01）,Rho A和MLC表达呈上升趋势,但是无统计学意义（P>0.05）,电针百会、足三里和法舒地尔干预可显著下调ROCK2、MYPT1和MLC1表达（P<0.05）,电针组的Rho A表达下调,但是无统计学意义（P>0.05）。电针组和法舒地尔组之间没有显著差异。②免疫荧光显示:与假手术组比较,模型组Rho A和ROCK2表达明显增加（P<0.01）,电针和法舒地尔可显著下调Rho A和ROCK2表达（P<0.05）。③q-PCR显示:与假手术组比较,模型组的Rho A,ROCK2,MLC1和MYPT1的mRNA 水平有上调趋势,但无统计学意义（P>0.05）,电针可显著下调模型组的ROCK和MLC1的mRNA水平（P<0.05）。5.电针百会、足三里对CIRI大鼠脑组织神经可塑性相关蛋白（GAP43,BDNF,Synap）的表达神经可塑性是脑功能康复的重要基础。①western blot结果显示:与假手术组相比,模型组GAP43、BDNF水平明显降低（P<0.01）,模型组Synap表达无明显变化（P>0.05）。另外,电针可显著增加GAP43和BDNF水平（P<0.01,P<0.05）,电针组Synap水平无显著变化（P>0.05）。②免疫荧光显示:与模型组相比,电针组BDNF表达上调（P<0.05）。③q-PCR显示:与假手术组相比,模型组GAP43和Synap的mRNA水平下降（P<0.05）,BDNF的mRNA水平呈下降趋势（P>0.05）。电针或法舒地尔可上调GAP43和BDNF的mRNA水平,但是无统计学意义（P>0.05）,电针组和法舒地尔组比较无显著差异。结论1.脑缺血再灌注损伤7d后,模型组大鼠右侧大脑中动脉供血区可见梗死病灶,并且损伤侧海马区神经元超微结构破坏严重,神经功能评分低下。电针百会、足三里可以减小脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积,改善大鼠神经功能评分,减轻神经元损伤。2.脑缺血再灌注损伤7d后,模型组大鼠脑组织中枢微环境中抑制因子NogoA、MAG表达显著升高,电针百会和足三里可调节CIRI大鼠中枢微环境中Nogo A、OMgp、MAG及其受体NgR的表达,减轻中枢微环境的抑制作用,发挥脑保护作用。3.脑缺血再灌注损伤7d后,脑组织神经再生抑制性信号Rho A/ROCK通路相关蛋白（RhoA、ROCK2及MYPT1）表达显著升高,电针百会和足三里可显著下调Rho A/ROCK通路及其下游靶分子MLC1,MYPT1的表达,减轻轴突损伤,且电针百会、足三里穴的干预作用和法舒地尔相当。4.脑缺血再灌注损伤7d后,脑组织神经可塑性相关蛋白（GAP43、BDNF及Synap）表达低下,电针百会、足三里可促进GAP43、BDNF的表达,促进神经轴突再生。创新点本论文从中枢损伤微环境中存在的抑制因子、轴突再生抑制性信号Rho A/ROCK通路及神经可塑性相关蛋白的表达,三个方面探讨了电针百会和足三里穴对脑I/R后神经轴突再生信号的影响,并且比较电针百会、足三里干预和阳性对照药物盐酸法舒地尔干预的功能差异,在科学思路和研究内容上具有创新性。本论文重点探讨CIRI大鼠脑组织中MAIs介导的Rho A/ROCK神经再生抑制途径与电针百会、足三里穴的干预作用。选择MAIs介导的Rho A/ROCK神经再生抑制这条途径,采用Garcia神经功能评分对大鼠进行神经行为学评价;TTC染色和透射电镜观察脑组织病理形态学变化;通过Western Blot、免疫荧光和实时荧光定量PCR法检测脑组织中MAIs及受体（Nogo-A、MAG、OMgp、NgR）及Rho A/ROCK通路相关蛋白（Rho A、ROCK2、MLC1、MYPT1）和神经可塑性相关蛋白（GAP43,BDNF,Synap）的表达。验证电针百会、足三里可通过改善大鼠中枢损伤微环境,抑制Rho A/ROCK介导的神经再生抑制途径,促进轴突再生,从而减轻CIRI的科学假说,为电针防治脑缺血再灌注损伤进一步提供科学依据。