番茄(Solanum lycopersicum)是全世界最重要的蔬菜作物之一,在我国蔬菜产业中具有重要的地位,同时,它也是植物科学研究的重要模式植物之一。利用番茄揭示植物抗逆机制创造抗逆新种质具有重要理论意义和应用价值。本课题前期筛选到2个番茄抗旱渐渗系(IL),通过基因芯片差异杂交技术,获得了一些与番茄耐旱相关的候选基因,通过转基因功能验证,从13个候选基因中鉴定出4个与抗非生物逆境相关的基因,其包含：]HyPRP (hybrid proline-rich protein)和DBB (Double B-box zinc finger protein)基因,这两个基因在植物抗非生物逆境还未见报道；另外两个与矮化相关的基因,SIDREB和SljmjC,这两个基因分别导致赤霉素敏感和不敏感的矮化,矮化植株由于减少了在逆境下自身的能量损失从而抵御不良环境,可以说矮化也是植物对抗非生物逆境的一种适应。本研究利用这些有表型的转基因植株为材料,从表型、细胞学、生理生化和分子水平展开研究,分别从转录或蛋白水平解析这些基因在番茄抗旱相关代谢途径及信号传导因子的变化,从系统生物学的角度阐明这些基因在番茄非生物逆境中的作用机理。主要研究结果如下：1.杂合脯氨酸富集蛋白基因HyPRP的克隆和功能解析：杂合脯氨酸富集蛋白(HyPRP)的氨基酸序列同时含有一个脯氨酸富集的区域和一个8CM (eight-cysteine motif)结构域,它是在番茄中发现的一类新基因,这个基因受多种非生物逆境的负向调控表达,比如干旱、高盐、冷、热、氧化和脱落酸。通过超量和RNAi抑制表达这个基因的转基因功能分析,我们发现抑制该基因表达后,番茄表现较强的抗盐,抗脱水和抗氧化能力,为了研究其在抗逆中的分子机理,我们以这个基因全长序列作钓饵酵母双杂筛选番茄的cDNA文库,找出与其互作的蛋白,发现HyPRP和二氧化硫氧化酶(SO),铁硫蛋白(Fds)和蛋氨酸硫氧化物还原酶(Msr)互作,其中SO和Fds可分别从氧化途径和还原途径将植物体内有毒害的亚硫酸盐转化为没有毒害的硫酸盐,Msr酶具有清除植物体内的超氧自由基的功能,而亚硫酸盐和超氧自由基是空气中二氧化硫污染所产生的主要毒害物质。进一步研究结果表明,抑制表达HyPRP可以显著的提高番茄抗二氧化硫毒害的能力。而且在二氧化硫处理发生时,HyPRP抑制系相对于野生型对照中积累了较少的亚硫酸盐和较高的Msr和Fds。这些都说明HyPRP作为一个非生物逆境负调控的基因,可能通过调控Msr、SO和Fds这几个基因来提高植物抗二氧化硫和氧化毒害的能力。2.转录因子SIDREB导致番茄赤霉素敏感矮化的分子机理解析：本研究中,我们分离了番笳的一个SIDREB基因,通过在酵母中的表达和亚细胞定位证明它是一个典型的转录因子。我们分离并克隆了这个基因,并且发现超量表达这个基因导致番笳植株矮化,抗旱性增强。表达分析的结果表明,SIDREB主要在茎和叶中表达量高,并且受ABA的诱导表达,但在GA和乙烯的处理下均下调表达,而且具有一致得表达模式。SIDREB在番茄中超量表达时,通过限制叶片膨大和节间伸长,改变植物的形态结构,导致植株整体矮化,并且这种矮化在施加外源GA3的作用下表型可以得到恢复。为了进一步研究SIDREB导致GA敏感矮化的分子机理,我们对转基因和野生型对照中的GA合成和信号传导中的所有报道的基因做了表达分析,结果表明SIDREB的超量表达导致了番茄中的两个GA合成的两个关键基SlCPS和GA20-氧化酶(SlGA20ox1、2和4)的显著下调表达,从而导致转基因植物中的内源GAs含量显著下降。而且酵母单杂实验表明SIDREB可以特异性结合SlCPS启动子区域的DRE/CRT顺式作用原件,推测SIDREB可能直接调控SICPS.所以,SlDREB通过直接或者间接抑制GA合成中关键基因的表达,导致内源GA合成减少,使番茄节间变短,植株整体矮化,从而在不利的环境下的避免过多的能量损失,从而产生抗旱性。3.番茄SljmjC导致番茄赤霉素不敏感矮化的分子机理解析：我们从番茄中分离出来这个jmjC基因的氨基酸序列和其他物种中具有较高的同源性,且广泛存在于很多物种中。表达分析表明SljmjC受到GA的负调控表达,存GA处理的初期SljmjC的表达量迅速下降。RNAi抑制表达SljmjC导致番茄的严重矮化,叶片变小皱缩,节间变短,生殖生长期植株皱缩矮化更加严重,而且这种矮化表型在外源喷施GA3的作用下矮化表型不能够得到恢复。通过对矮化植株和野生型对照进行RNA-seq转录组分析,发现GA生物合成的相关基因如GA20oxs和GA3oxs在转基因植株中的表达明显提高,测定植物内源的各种类型的GA结果表明,有些类型的GA如：GA53、GA20和GA4在转基因植株内有较高的含量,也进一步说明SljmjC抑制的矮化不是一种GA缺陷型的矮化。为了进一步解析其导致矮化的机理,我们分析RNA-seq转录组数据发现两个缺少N端的DELLA结构域的类DELLA蛋白370和380在转基因植株中有较高的表达。于是分别克隆了370和380这两个基因并且通过转基因的方法将其在番茄中超量表达,结果表明超量表达370也导致番茄的矮化,而380没有明显的矮化表型。进一步我们通过亚硫酸盐处理DNAPCR甲基化分析发现SljmjC的抑制系中370的CpG甲基化程度比野生型低。所以SljmjC的抑制表达降低了370这个基因编码区的CpG甲基化程度,从而使这个基因激活表达,导致了植株GA不敏感的矮化。4.番茄转录因子DBB的克隆和功能解析：DBB (Double B-Box)基因是一种新的锌指蛋白转录因子,其在非生物逆境中的功能还未见报道。我们发现这个DBB基因包含有两个串联的B-Box结构域,并且含有这种结构的基因是在其它植物中广泛存在并且其氨基酸序列具有较高的同源性。表达分析结果表明这个基因在干旱、高盐、伤害、低温、氧化胁迫和ABA的处理下迅速上调表达,并且在植物的茎和叶片中有比较高表达。通过转基因功能分析,我们发现抑制表达DBB可以显著提高番茄植株的抗旱性,进一步的RNA-seq转录组分析表明在干旱胁迫下,相比野生型对照而言,蛋白酶抑制剂类和UDP-糖基转移酶基因在DBB抑制系中具有较高的表达,相反在DBB超表达系中却显著下调表达,这两类基因和DBB在干旱胁迫的情况下有共同的表达模式,而这两类基因在植物的抗非生物逆境中有重要的功能,DBB调控这两类基因的表达也解释了抑制表达DBB提高植株抗旱性而超量表达使其更加敏感的原因。5.番茄SpZPRl基因的克隆与表达分析：我们从番茄野生种潘那利(S. pennellii LA0716)分离出了一个ZPR1基因,命名为SpZPR1。SpZPR1的氨基酸序列和其他物种具有较高的同源性,并且具有同样的锌指结构。表达结果表明SpZPRl在番茄顶端分生组织中表达最高,而且不管在野生种还是栽培种番茄中,这个基因都受到ABA和高温诱导表达。将SpZPRl在酵母中的表达表明它在酵母中具有转录激活的活性,而我们的凝胶电泳迁移率分析(EMSA)的结果表明SpZPR1是能够特异的结合ABA反应元件ABRE(ABA反应元件)顺式作用元件。SpZPR1是我们首次从植物里面分析出来的一类锌指蛋白,他可能在ABA信号网络中调控植物抵御非生物逆境中具有重要的作用。