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第一章小鼠IL-10及TNF-α启动子荧光素酶报告质粒的构建目的：构建小鼠IL-10及TNF-α野生型及突变型启动子荧光素酶报告质粒。方法：分析IL-10及TNF-α启动子区域,采用PCR技术从小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7中扩增出启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中成为野生型报告质粒。再以野生型质粒为模板设计引物定点突变启动子核心区域,突变完成后同样连接于pGL3-basic载体质粒。酶切及测序鉴定所构建质粒。结果：经过双酶切后凝胶电泳,IL-10及TNF-α启动子报告质粒分别得到约680bp、240bp长度的片段。质粒测序发现野生型报告质粒序列与Gene Bank比较碱基排列一致,无碱基突变、缺失。突变型IL-10、TNF-α启动子核心区域碱基“ttctggaa”、“GAA”分别被替换为“tactgccc”、“GCC”,形成突变型报告质粒。结论：成功构建小鼠IL-10及TNF-α野生型和突变型启动子荧光素酶报告质粒。第二章NF-κB p65亚基真核表达质粒的构建目的：构建小鼠NF-κB p65亚基真核表达质粒。方法：从培养的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7中提取总RNA,逆转录得到DNA,利用PCR方法钓取目的基因,将目的基因与目的载体pcDNA3.1(-)分别进行酶切。酶切产物电泳回收后进行定向连接,其产物转化细菌感受态。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的即为构建成功的目的质粒。结果：经过RT-PCR得到长度约1660bp的DNA片段。阳性转化子测序发现DNA序列两处发生同义突变,但不影响其翻译结果,其余碱基排列无缺失或突变。结论：通过RT-PCR克隆出小鼠NF-κB p65亚基基因,并成功连接于目的载体,为进一步研究NF-κB在烧伤后免疫反应中的作用机制打下实验基础。第三章烧伤血清对HSF1调控NF-κB启动活性的影响目的：观察烧伤血清刺激后小鼠巨噬细胞NF-κB启动子活性的变化,以及过表达HSF1对NF-κB可能的调控作用。方法：制作15%TBSAⅢ°烧伤小鼠模型,提取烧伤血清。通过表达质粒与报告质粒共转染,检测烧伤血清诱导下NF-κB启动子活性的变化以及过表达HSF1后NF-κB活性的变化规律。结果：对比正常血清,烧伤血清刺激后NF-κB启动子相对荧光素酶活性早期即明显增加(P<0.05),这种变化在诱导后2小时即达到高峰,12小时后逐渐下降；过表达HSF1可以显著抑制烧伤血清引起的这种变化(P<0.05)。结论：NF-κB是一个受HSF1调控的转录因子,在烧伤后早期活化,HSF1过表达可以直接抑制NF-κB的启动活性。第四章烧伤血清诱导下HSF1与NF-κB相互作用对TNF-α、IL-10和HMGB1启动活性的影响目的：观察在烧伤血清诱导下,HSF1与NF-κB(?)目互作用对早晚期炎症介质的调控作用,综合前期研究成果从HSF1水平探讨烧伤后重要炎症因子的表达调控及可能的机制。方法：以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为研究对象,采用脂质体瞬时共转染HSF1与NF-κB p65亚基表达质粒及炎症因子TNF-α、IL-10、HMGB1启动子荧光素酶报告质粒,同时以海肾萤光素酶载体phRL-SV40为内参,根据不同实验分组检测烧伤血清诱导后启动子荧光素酶的相对值。结果：在20%烧伤血清诱导2小时后,TNF-α、HMGB1、IL-10三种炎症基因启动子报告质粒空白质粒组、空白细胞组、单纯过表达p65组三者两两比较启动子活性接近,无明显差别(p>0.05)。过表达HSF1后TNF-α、HMGB1IL-10启动子活性较空白质粒组分别升高1.92倍、2.62倍及1.5倍；同时过表达p65与HSF1后较空白质粒组则分别升高1.29倍、2.74倍1.13倍,均较空白质粒组显著增加(p<0.05)。相对于单纯过表达HSF 1,同时过表达p65后TNF-α、IL-10启动子活性较前下降,差别明显(p<0.01)。分别用10%、20%、40%浓度烧伤血清刺激,随着浓度增加炎症因子启动子活性亦升高。结论：p65亚基对构建的三种炎症基因启动子报告质粒无调控作用；HSF1可能通过与NF-κB相互作用而对TNF-α、IL-10启动子发挥调控作用；随着烧伤程度的增加,HSF1与NF-κB可以增加炎症因子TNF-α、HMGB1、IL-10启动子活性。