旋毛虫病是一种呈世界性分布的人兽共患寄生虫病,是由于生食或食用了未熟的感染了旋毛虫的肉类而感染。人和动物感染旋毛虫在中国大多数省份均有报道,旋毛虫病不仅严重威胁公众健康,同时还影响养猪业的经济效益和肉类食品安全。因此,需要发展疫苗来阻断旋毛虫从家养动物向人类的传播。我们课题组前期应用Western blot和鸟枪法液相色谱质谱联用（shotgun LC-MS/MS）技术,使用旋毛虫感染小鼠及病人的早期血清从成虫的排泄分泌（ES）蛋白中筛选出了旋毛虫成虫特异性DNase II-1（TsDNase Ⅱ-1）/DNase II-7（TsDNase Ⅱ-7）。脱氧核糖核酸酶II（DNase II）是一种广泛存在的核内切酸酶,可以通过水解DNA的磷酸二酯键降解DNA而发挥其生化功能,并且在逃避宿主免疫防御和病原体入侵过程中发挥重要作用。DNA疫苗利用真核表达载体,所表达蛋白经过折叠和修饰,比原核表达的蛋白更近似于天然构象。利用减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体,通过口服的方式进行免疫可以更有效地诱导粘膜免疫应答,更有利于杀伤和排出寄生于宿主肠道的虫体。本研究克隆表达、纯化了rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7,免疫小鼠获得了免疫血清,通过Real-time PCR、Western blot和间接免疫荧光试验（IIFT）鉴定了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛虫不同发育时期的转录、表达及定位;观察了抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫血清对旋毛虫体外侵入肠上皮细胞（IEC）单层的抑制作用及抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7特异性抗体介导的巨噬细胞对旋毛虫新生幼虫的杀伤作用;构建了减毒沙门氏菌为载体的TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7DNA疫苗,检测了rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7皮下接种免疫及口服DNA疫苗免疫小鼠的免疫应答类型和对小鼠的免疫保护效果,证实了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7可作为抗旋毛虫感染疫苗的候选靶标蛋白。材料与方法1.实验动物、旋毛虫虫种、菌株及细胞系本研究使用的实验动物为6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠,购自河南省实验动物中心。旋毛虫虫种（T1,ISS534）是由本实验室小鼠每6个月传代保种。鼠伤寒沙门氏菌⊿cyaSL1344株来自河南科技大学动物科技学院动物疫病与公共安全重点实验室。实验所用小鼠小肠上皮细胞IEC由本课题组前期分离获得;乳仓鼠肾细胞BHK-21来自河南省疾控中心细胞资源中心。2.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的生物信息学分析及表达与鉴定利用NCBI、ExPasy、BepiPred等在线软件对TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的结构域、理化性质及抗原位点进行生物信息学分析;从3d成虫cDNA中扩增TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7基因并构建原核表达质粒对rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7进行表达和纯化,通过Real-time PCR、Western blot和IIFT分析了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛虫肌幼虫、肠道感染性幼虫（IIL）、成虫和新生幼虫时期的转录、表达及定位。通过体外侵入IEC单层和ADCC实验观察TsDNase Ⅱ特异性抗体对旋毛虫侵入中的作用。3.rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠诱导的免疫应答将纯化的重组蛋白rTsDNase Ⅱ-1、rTsDNase Ⅱ-7、rTsDNase Ⅱ-1+7混合蛋白、佐剂及PBS分别皮下注射免疫小鼠。初次免疫后0、10、20和30d尾静脉采血收集小鼠血清,运用间接ELISA方法检测并分析rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠后引起IgG、IgG1和IgG2a水平的变化。4.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7重组沙门氏菌DNA疫苗的构建及鉴定构建真核重组质粒pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7,用脂质体法将其转入BHK-21细胞中,用RT-PCR和IIFT鉴定质粒在体外的转录和表达。将重组质粒用电转法转化进入减毒沙门氏菌后口服免疫小鼠,免疫后1周采集小鼠脾脏和肠系膜淋巴结,用RT-PCR和IIFT鉴定质粒在小鼠体内的转录和表达。5.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫应答收集DNA疫苗初次免疫后0、10、20和30d的小鼠血清、肠道冲洗液、脾细胞和肠系膜淋巴结细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a的水平和肠液中总IgA、特异性IgA水平。将脾细胞和肠系膜淋巴结细胞分别用rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7刺激72h,收集细胞培养上清,采用双抗体夹心ELISA法检测细胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-10）的水平。此外,应用IIFT检测免疫小鼠血清IgG和肠道冲洗液IgA对旋毛虫不同发育时期虫体的识别,进一步验证DNA疫苗所引起的免疫应答。6.rTsDNase Ⅱ及DNA疫苗免疫对小鼠的免疫保护作用分别用皮下注射rTsDNase Ⅱ和口服DNA疫苗2种途径免疫小鼠,末次免疫后10d,每只小鼠经口感染300条旋毛虫肌幼虫。攻击感染后5d剖杀小鼠,收集肠道成虫并计算成虫减虫率;感染后42 d剖杀小鼠收集肌幼虫并计算肌幼虫减虫率,以观察免疫保护效果。7.统计学处理使用SPSS 17.0统计分析软件对实验数据进行分析统计。数值的表述方式为平均值±标准差。多个实验组之间的比较运用单因素方差分析,两组间比较使用t检验和卡方检验,检验显著性水平:α=0.05。结果1.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的生物信息学分析及表达与鉴定测序结果表明,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的完整cDNA序列分别为1221 bp和1161bp,预测的开放阅读框分别编码347和348个氨基酸,分子量大小分别为38.06 kDa和38.22 kDa,等电点分别为7.58和7.56。Western blot分析结果显示,IIL、成虫、新生幼虫粗提蛋白和成虫ES蛋白中的天然TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7可以被抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7的血清识别。Real-time PCR结果表明,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛虫各发育期虫体均有转录;IIFT结果显示,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在成虫和新生幼虫虫体表面均有表达,并且主要位于虫体组织切片的表皮和杆状体。经抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7血清孵育的IIL,体外对肠上皮细胞的侵入率分别为40.13%和32.65%,明显低于免疫前血清组（4.01%,χ₁²=105.012,χ₂²=70.118,P<0.01）;ADCC结果显示,抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7血清组的新生幼虫死亡率（66.84%和63.39%）明显高于免疫前血清组（15.30%,t₁=26.420,t₂=22.599,P<0.01）,对新生幼虫的这种细胞毒性具有抗体剂量依赖性（F₁=69.569,F₂=68.231,P<0.01）。2.rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠诱导的免疫应答rTsDNase Ⅱ-1、rTsDNase Ⅱ-7和2种蛋白混合免疫小鼠均可产生高滴度的血清特异性抗体,且rTsDNase Ⅱ-1(t_20d=13.318,t_30d=56.608,P<0.01)、rTsDNase Ⅱ-7(t_20d=17,507,t_30d=22.466,P<0.01)和2种蛋白混合(t_20d=7.821,t_30d=24.942,P<0.01)免疫小鼠后20和30 d,血清IgG1水平均明显高于IgG2a水平,表明rTsDNase Ⅱ免疫小鼠后引起了以Th2型为主的Th1/Th2混合型免疫应答。3.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7重组沙门氏菌DNA疫苗的构建及鉴定双酶切和测序验证结果证明成功构建了△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗。体外转染BHK-21细胞后,RT-PCR和IIFT检测结果显示转染细胞中存在TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7基因转录和蛋白表达。对DNA疫苗免疫1周后的小鼠脾脏和肠系膜淋巴结进行RT-PCR和IIFT实验,结果表明经口免疫TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗,TsDNase Ⅱ在脾脏和肠系膜淋巴结中成功转录和表达。4.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫应答小鼠经ΔcyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和ΔcyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7第2次和第3次免疫后,血清特异性IgG水平均有明显升高,且IgG1水平明显高于IgG2a水平（P<0.01）;肠道冲洗液中总IgA和特异性IgA也均有明显的升高。在初次免疫后10d、20d和30d,小鼠脾细胞和肠系膜淋巴结细胞经rTsDNase Ⅱ-1或rTsDNase Ⅱ-7刺激后,IFN-γ、IL-4和IL-10水平明显高于空质粒组和PBS组（P<0.01）,表明TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠后引起了Th1/Th2免疫应答,并诱导了粘膜免疫应答。5.rTsDNase Ⅱ及DNA疫苗免疫对小鼠的免疫保护作用rTsDNase Ⅱ-1免疫组的成虫减虫率（40.36%）明显高于rTsDNase Ⅱ-7免疫组（34.86%）（t=2.480,P<0.05）;2个免疫组的肌幼虫减虫率（50.43%vs 42.33%）的差异无统计学意义（t=1.008,P>0.05）。TsDNase Ⅱ-1 DNA疫苗组的成虫减虫率（53.85%）亦明显高于TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗组（46.15%）（t=3.253,P<0.05）,2个免疫组的肌幼虫减虫率（59.26%vs53.41%）的差异也无统计学意义（t=1.685,P>0.05）。结果表明,rTsDNase Ⅱ蛋白和DNA疫苗免疫接种均对小鼠产生了部分免疫保护效果。TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫的小鼠,肠道成虫减虫率明显高于rTsDNase Ⅱ蛋白免疫组（t₁=2.670,t₂=2.812,P<0.05）;TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗口服免疫小鼠的肌幼虫减虫率与rTsDNase Ⅱ-1或rTsDNase Ⅱ-7蛋白免疫组相比差异无统计学意义（t₁=1.641,t₂=1.429,P>0.05）。结论1.成功构建了pQE-80L-TsDNase Ⅱ-1/7重组表达质粒,并表达了rTsDNase Ⅱ-1/7蛋白;TsDNase Ⅱ-1/7在旋毛虫不同发育时期均有转录,在除肌幼虫外的各发育时期均有表达,主要定位在虫体的皮层、杆状体和胚胎。2.构建了△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1/7 DNA疫苗,2种DNA疫苗免疫小鼠均引起了以Th2型为主的Th1/Th2混合型免疫应答以及特异性的黏膜免疫应答。3.TsDNase Ⅱ-1/7 DNA疫苗口服或rTsDNase Ⅱ皮下注射免疫小鼠均可产生对旋毛虫感染的部分免疫保护作用,各免疫组间肌幼虫减虫率的差异无统计学意义,但TsDNase Ⅱ-1 DNA疫苗免疫小鼠后成虫的减虫率明显高于TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗组及rTsDNase Ⅱ蛋白免疫组。4.TsDNase Ⅱ为旋毛虫侵入相关蛋白并可作为旋毛虫疫苗的候选靶向分子。