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肝激酶B1（LKB1）也称为丝氨酸/苏氨酸激酶11（STK11）,是1998年首次在Peutz Jeghers综合征（PJs）患者中发现的抑癌基因。它的种系突变是PJs患者的主要致病因素,也是癌症易感性的重要遗传基础。LKB1具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,通过使底物蛋白的磷酸化或与靶蛋白的结合,LKB1蛋白调节着基因表达并参与细胞周期,细胞凋亡和其他生命活动的调控。我们以前的研究发现,LKB1与h TERT和h TERC的表达成反比。据报道,PJs患者中GLUT1上调。在肺癌中,LKB1影响GLUT1表达的分子机制尚待阐明。在许多癌症中,PTEN活性及功能的丧失已经被广泛认识,他被认为是癌症发生和发展关键环节。与大多数蛋白质酪氨酸磷酸酶不同,已知PTEN优先使磷酸肌醇底物脱磷酸。LKB1与PTEN相互作用并使之磷酸化。这种相互作用的丧失可能是肿瘤发生的原因之一。据报道,活化的PTEN通过负调节AKT活性而发挥抗癌作用,通过抑制AKT磷酸化来抑制细胞增殖和迁移并促进细胞凋亡。免疫共沉淀和体外去磷酸化试验的实验表明,PTEN与AKT发生物理相互作用并驱动其去磷酸化,因此限制了GLUT1在质膜上的表达。在本研究中,我们首次揭示了肺癌细胞中的LKB1蛋白通过诱导PTEN磷酸化来激活其抗癌活性,然后通过诱导AKT去磷酸化而丧失其致癌活性,最后在蛋白和mRNA水平下调了GLUT1的表达。目的:是阐明肺癌细胞中LKB1,PTEN,AKT和GLUT1之间的调控机制,并为治疗HPV相关性肺癌提供新的策略。研究方法:首先我们采用细胞转染及细胞干扰技术双向调控LKB1后,通过蛋白免疫印迹（Western blotting）的实验方法检测LKB1、PTEN、AKT、GLUT1、p-PTEN及p-AKT蛋白的表达变化,并且采用实时定量聚合酶链锁反应（q RT-PCR）检测LKB1、PTEN、AKT及GLUT1 mRNA的表达变化;接着,我们采用细胞干扰技术调控PTEN后,通过蛋白免疫印迹（Western blotting）的实验方法检测PTEN,AKT、GLUT1及p-AKT蛋白的表达变化,并且采用实时定量聚合酶链锁反应（q RT-PCR）检测PTEN、AKT及GLUT1 mRNA的表达变化;并且通过加入AKT通路抑制剂抑制信号通路作用以明确其对GLUT1表达的影响;然后我们应用核浆分离技术明确LKB1对PTEN、p-PTEN核浆表达情况的影响;应用免疫荧光技术更进一步证实LKB1及PTEN对GLUT1表达的影响。采用SPSS22.0统计分析软件对实验数据进行t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、过表达LKB1上调p-PTEN的表达,下调p-AKT和GLUT1的表达;为了研究LKB1对p-PTEN、p-AKT和GLUT1的影响,将pc DNA3-LKB1-His载体瞬时转染到低表达细胞系A549中,结果显示,LKB1过表达上调PTEN和p-PTEN的蛋白表达,下调p-AKT蛋白和GLUT1的蛋白和mRNA表达。而PTEN的表达量明显低于p-PTEN,AKT的表达量变化不大或没有变化。另一方面,抑制LKB1在NCI-H460细胞中得到相反的结果。2、PTEN的下调上调了p-AKT和GLUT1的表达;为了进一步验证PTEN、p-AKT和GLUT1的调控作用,我们使用PTEN特异性Si RNA在NCI-H460细胞中下调PTEN的表达。3、敲除PTEN可通过激活AKT信号通路上调GLUT1的表达,我们首先检测Si RNA干扰后PTEN的表达水平,然后进行后续实验。在NCI-H460细胞系中转入PTEN Si RNA干扰后,AKT信号通路的关键蛋白总AKT的表达水平没有改变,但p-AKT的表达水平显著升高。随着p-AKT表达水平的升高,GLUT1表达水平也随之上调。然而,我们在NCI-H460细胞中加入AKT信号通路抑制剂Miltefosine后,p-AKT和GLUT1的表达水平明显逆转。4、在NCI-H460细胞系中下调LKB1,细胞浆内p-PTEN的表达降低,细胞浆内总PTEN表达略降低,上调细胞核内PTEN的表达。5、在A549细胞系中上调LKB1,细胞浆内p-PTEN的表达上调,细胞浆内PTEN的表达略升高,细胞核内PTEN的表达降低。6、通过转染LKB1 Si RNA到NCI-H460细胞中,通过免疫荧光技术观察GLUT1的荧光信号定位在细胞浆及细胞膜并且信号增强。7、通过转入PTEN Si RNA到NCI-H460细胞中,观察到GLUT1的荧光信号定位在细胞浆及细胞膜并且信号增强,再加入AKT通路抑制剂后,GLUT1的荧光信号几乎在细胞浆内并且荧光信号弱。结论:1.本课题验证了在肺癌细胞模型中,LKB1能够抑制GLUT1蛋白及mRNA的表达。2.LKB1通过促进细胞浆中PTEN在Ser380位点的磷酸化促进细胞核中PTEN向细胞质转运。3.LKB1调控PTEN激活,从而通过抑制AKT信号通路激活抑制GLUT1的表达。4.我们的研究结果为LKB1和PTEN在肺癌发生的抑制作用及两者对GLUT1的调控机制研究提供了新的证据,并可能提示新的治疗靶点。