大量研究证据表明，许多生长因子和受体存在于早期胚胎和雌性生殖道中，哺乳动物早期胚胎的发育受到母源和胚胎自身生长因子的调节，生长因子以旁分泌、自分泌和内在分泌的方式作用于胚胎，调节胚胎细胞的功能。体外培养液中添加的外源生长因子可以改变胚胎细胞的发育命运和细胞的代谢能力。本研究主要通过免疫组织化学和R了-PCR的方法检测了EGF、TGFα及其受体EGFR在绵羊卵母细胞、早期胚胎和雌性生殖道中的表达情况；在成熟培养液和发育培养液中添加不同剂量的EGF、TGFα，观察其对卵母细胞和胚胎发育的影响；采用RNAi的方法进一步探讨了TGFα及其受体在绵羊早期胚胎发育中的作用。一、RT-PCR方法检测EGF、TGFα和EGFR在卵母细胞、早期胚胎和生殖系统中的表达1．EGF、TGFα和EGFR mRNA在卵母细胞、早期胚胎中的表达通过RT-PCR的方法检测了EGF、TGFα和EGFR mRNA在卵母细胞、早期胚胎中的表达情况。结果显示在卵母细胞和早期胚胎中均未检测到EGFmRNA的表达。在未成熟的卵母细胞、成熟的卵母细胞和早期胚胎中均有TGFα和EGFR mRNA的表达，成熟卵母细胞中的表达量明显高于未成熟卵母细胞中的表达量。实验结果表明卵母细胞在成熟过程中丰富地储存了这两种生长因子的mRNA，随着胚胎的发育储存的mRNA迅速减少。TGFαmRNA的量在8细胞期下降到最低水平，并随着胚胎基因组的激活胚胎开始转录TGFα，使TGFαmRNA表达总量保持在一定水平，持续到桑椹胚期；EGFR mRNA的量在胚胎发育到桑椹胚期下降到最低，而囊胚期胚胎中的整体表达量又上升。2．EGF、TGFα和EGFR mRNA在生殖系统中的表达通过RT-PCR的方法检测了EGF、TGFα和EGFR mRNA在生殖系统中的表达。结果表明在卵巢细胞和排卵后的输卵管上皮、子宫上皮和胎盘小叶细胞中均没有检测到EGF mRNA。EGFR mRNA在排卵后7-8天的子宫上皮细胞和胎盘小叶中表达水平相对较高，而在卵巢细胞和排卵后输卵管中的转录水平较低；TGFαmRNA在输卵管中的表达水平明显高于子宫上皮和胎盘小叶。输卵管中TGFα维持在较高水平可能有利于早期胚胎的发育，EGFR在子宫和胎盘小叶中的高表达可能有利于上皮细胞的进一步增殖分化，为胚胎的着床和胎儿妊娠提供合适的环境。二、免疫组织化学的方法检测TGFα和EGFR在卵母细胞、早期胚胎和生殖系统中的表达1．TGFα和EGFR蛋白在卵母细胞、早期胚胎中的表达通过免疫组织化学的方法研究了TGFα和EGFR蛋白在卵母细胞、早期胚胎中的表达情况。EGFR和TGFα在未成熟卵母细胞、卵丘细胞和成熟卵母细胞的细胞膜区域均有表达，TGFα在受精卵中的表达量明显增加。EGFR、TGFα从2细胞到囊胚期的胚胎中均有表达，到了扩张囊胚期EGFR主要分布在滋养外胚层细胞，而在内细胞团中表达量相对较低。TGFα主要存在于接近细胞膜的膜下区域，在囊胚中，内细胞团和滋胚层细胞中均丰富地表达。体内胚胎与体外胚胎表达情况基本一致。2．EGFR蛋白的表达形式通过蛋白印迹的方法表明：在卵母细胞和早期胚胎中存在两种不同构型的EGFR，即野生型(170KD)和突变型Ⅷ(145KD)。未成熟和成熟的卵母细胞中主要存在Ⅷ突变型，而野生型表达相对较少，成熟后卵母细胞中的Ⅷ突变型蛋白明显增加。在第二天、第四天的胚胎中野生型和突变体形式受体的表达量均明显增加。3．TGFα和EGFR蛋白在生殖系统中的表达免疫组织化学的结果表明，TGFα在生长卵泡的颗粒细胞和排卵后0,2-3,4-5,6-7天的输卵管管腔、6-7天的子宫上皮和子宫腺中均有较强的表达。然而在退化卵泡中没有表达。EGFR仅在卵泡的颗粒细胞和排卵后6-7天的子宫上皮中才有表达，但在排卵后0-7天的输卵管中均没有表达。在子宫腺和生长卵泡的壁层颗粒细胞中有较弱的表达。三、EGF和TGFα对卵母细胞成熟的影响未成熟卵母细胞分别在TCM199基础培养液+血清、TCM199基础培养液+BSA+EGF、TCM199基础培养液+BSA+TGFα和TCM199基础培养液+BSA四组成熟培养系统中成熟培养，22小时后上述各组卵母细胞的核成熟率分别为75.2％、73.1％、69.8％、63.5％，处于第一次减数分裂末期的比率分别为16.3％、15.9％、16.9％、27.0％，在添加血清、EGF、TGFα各组中核成熟率显著高于其它各组(P＜0.05)，处于末期的比例明显低于其它各组(P＜0.05)：添加血清、EGF、TGFα各组在a-Tubulin蛋白的分布与表达上(66.6％、66.6％、73.6％)明显高于BSA组的正常率43.3％(P＜0.05)；各组CG发生迁移较好的卵母细胞的比率分别为58.8％、33.9％、54.7％、47.9％，血清组和添加EGF组CG迁移至皮质区的比例明显高于仅添加BSA处理组(P＜0.05)。结果表明TGFα和EGF促进了绵羊卵母细胞成熟过程中从第一减数分裂末期向第二减数分裂中期的转变，同时改善了α-Tubulin蛋白在卵母细胞中的正常表达与分布；EGF和血清均明显促进了绵羊卵母细胞CG的正常迁移：因此TGFα和EGF能够替代血清中的某些成分促进和改善体外成熟卵母细胞核成熟的质量，EGF比TGFα更能促进绵羊卵母细胞胞质的成熟。四、EGF和TGFα对胚胎发育的影响1．添加EGF和TGFα对胚胎发育的影响在化学成分明确的培养系统中添加不同剂量的EGF和TGFα对早期胚胎进行发育培养，结果表明，添加5ng／ml的TGFα、25ng／ml的EGF、5ng／mlTGFα+25ng／mlEGF和对照组的8细胞率和囊胚发育率分别为88.0％、75.8％、76.8％、77.8％和26.7％、19.2％、23.5％、18.6％，TGFα组8细胞期胚胎的发育率高于其他各组(P＜0.05)：囊胚率在各组之间无显著差异(P＞0.05)；各组囊胚期胚胎中平均数细胞分别为73、74、70、74，TGFα和EGF的添加对囊胚期胚胎细胞的总数均没有明显的影响；死亡细胞数分别为4.3％，18.5％，10.4％和23％，仅添加TGFα组与对照组和EGF组均有极显著的差异(P＜0.01)，与TGFα+EGF组之间有显著差异(P＜0.05)。结果表明TGFα明显促进了囊胚期细胞的存活，改善了早期胚胎细胞的发育命运。2．EGFRdsRNA、TGFαdsRNA注射对早期胚胎发育的影响2．1 EGFRdsRNA、TGFαdsRNA注射对目的基因表达和部分基因表达的影响未成熟卵母细胞中分别注射EGFR dsRNA、TGFa dsRNA和水，同时设立对照组(不注射组)，结果表明EGFRdsRNA、TGFa dsRNA的注射与注水和对照组相比明显降低了EGFR、TGFα目的mRNA的含量，注水和对照组之间基本一致。分别交叉检测EGFR和TGFαmRNA，TGFαdsRNA的注射使EGFR mRNA的表达总量明显下降，EGFRdsRNA注射后，TGFa mRNA在各组间基本一致：蛋白印记表明，TGFαdsRNA的注射使EGFR两种形式的蛋白表达量升高。免疫组织化学染色结果显示，dsRNA注射组与注水组和对照组相比，分别降低了EGFR和TGFα在胚胎中的表达量。成熟过程中表达量明显升高的基因β-actin、间隙连接蛋白(CX-43、CX-45)基因的mRNA与对照组相比均没有明显的变化。2．2TGFαdsRNA注射对早期胚胎发育的影响注射dsRNA的卵母细胞经成熟培养，体外受精后的胚胎体外发育结果如下：注射TGFαdsRNA组、注射TGFαdsRNA后培养液中加入10ng／ml TGFα组、注水组和对照组的卵裂率和囊胚率分别为48.1％、56.3％、56.4％、73.8％和12.9％、18.9％、16.1％、32.2％，注射TGFαdsRNA与注水组卵母细胞来源的胚胎之间在卵裂率和囊胚率方面没有显著的差异(p＞0.05)，与对照组之间均有显著差异(P＜0.05)，加入TGFα后卵裂率和囊胚率均比不添加组有一定提高。对照组和注水组的囊胚在内细胞团中仅存在少量的细胞凋亡现象，滋养外胚层也仅有个别的细胞发生了凋亡，而注射TGFαdsRNA后囊胚中滋养外胚层和内细胞团细胞的凋亡数量明显上升；注射TGFαdsRNA胚胎培养在添加10ng／ml TGFα的培养液中形成的囊胚，其滋养外胚层中凋亡的细胞明显低于添加TGFα培养组，内细胞团细胞并未见有明显的变化。结果表明TGFα表达量的下降没有影响胚胎的发育率，但增加了囊胚中细胞的凋亡，TGFα的加入能改善因内源TGFα减少而引起的滋养外胚层细胞的凋亡。2．3 EGFR dsRNA注射对早期胚胎发育的影响卵母细胞经过注射dsRNA后，注射EGFR dsRNA组、注水组和对照组卵母细胞的卵裂率、囊胚率和孵化率分别为：55.8％、69.7％、70.0％；18.1％、22.7％、30.7％和18.2％、33.7％、34.1％，注水组与对照组之间在这三个方面均没有显著的差异(P＞0.05)。注射EGFR dsRNA组与对照组和注水组之间相比较，卵裂率、囊胚率和孵化率在统计学上均有显著的差异(p＜0.05)；囊胚中细胞总数分别为80、90、94，内细胞团细胞数分别为22、24、23，滋养外胚层细胞数分别为58、66和71，在统计学上均没有明显的差异(p＞0.05)。结果表明EGFR介导的信号途径对受精卵的卵裂、囊胚的形成和孵化均有促进作用。