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斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)是我国成功引进的淡水鱼之一,近年来其养殖量逐年递增。内脏是水产加工业的副产物之一,其蛋白含量为11.90％,是较为良好的蛋白质源,对其进行深加工,不但可以增加其附加值,还能起到环境保护作用。本论文研究了酶解斑点叉尾鮰内脏蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽工艺、酶解液的纯化工艺以及分子量小于1000Da组分的功能特性。
1)斑点叉尾鮰内脏经过脱脂后,得到脂肪含量较低的蛋白。通过筛选得出木瓜蛋白酶为酶解鱼内脏蛋白制备血管紧张素转换酶(ACE)的最适酶,并研究该酶的酶解条件对酶解产物ACE抑制活性的影响。以酶解产物ACE抑制率为指标,通过响应面优化得出酶解产物ACE抑制率(Y)与酶解温度(A)、初始pH值(B)以及液料比(C)之间的二次方程为:
Y(％)=70.74+1.23A+0.98B+0.84C-0.28AB+0.072AC-0.095BC-10.69A2-16.02B2-1.61C2通过软件分析得到最佳酶解工艺条件为:酶解温度为55.29℃、pH值为7.51、液料比为2.26,在此水解条件下得到产物的ACE抑制率预期值为70.90％。酶解产物ACE抑制活性与水解度没有明显的线性关系。酶解产物氨基酸含量高,其中疏水性氨基酸的含量为39.13g／100g蛋白质。
2)在响应面优化得出的最优酶解方案下制备酶解液,使用截留分子量分别为1000Da和3000Da的超滤膜对酶解液进行分离纯化。酶解液经过超滤被分成3个组分,分子量小于1000Da组分具有较高的ACE抑制活性,其IC50值为1.052mg／mL。通过超滤分子量小于1000Da组分的IC50值由原水解液的1.596 mg／mL降低为1.052 mg／mL。使用葡聚糖凝胶树脂对分子量小于1000Da,组分进行进一步纯化,实验得出蒸馏水是合适的洗脱剂。分子量小于1000Da组分经过Sephadex G-25过滤得到4个组分,其中组分F2具有较高的ACE抑制活性,其IC50值为1.032mg／mL。使用Sephadex G-15对组分F2进一步纯化,得到2个主要组分,其中组分F21具有较高的ACE抑制活性,其IC50值为0.867mg／mL。使用RP-HPLC对组分F21进一步纯化,得到的组分H2具有较高的ACE抑制活性,其IC50值为27.46μg／mL。通过质谱分析得出组分H2的分子量为385.67Da,通过估算可知,组分H2为一个由3到4个氨基酸组成的短肽。
3)对分子量小于1000Da组分进行功能性质研究。分子量小于1000Da组分在pH值2.0-10.0范围内,其溶解度维持在95％左右。分子量小于1000Da组分在中性条件下在较高温度较长时间加热过程中能够保持良好的ACE抑制活性,当加热温度在80℃及以下时,分子量小于1000Da组分加热时间在60min以内,其对ACE的抑制活性能够维持在63％；分子量小于1000Da组分在90℃加热60min,其对ACE的抑制活性能够维持在60％左右。在实验室温度条件下,分子量小于1000Da组分在pH2.0-13.0溶液中保持1h,其ACE的抑制活性基本上没有发生变化,表明分子量小于1000Da组分具有较好的酸稳定性,并且在中性和酸性条件下稳定性更好。分子量小于1000Da组分经过肠道酶降解后,产物对ACE的抑制活性降低,但降低的幅度不大；分子量小于1000Da组分经过胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同作用后,其IC50值为1.863mg／mL。体外消化道模拟实验的结果表明,分子量小于1000Da组分具有良好的降血压生理功能。