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目的:骨骼肌是摄取餐后葡萄糖的主要器官,胰岛素刺激骨骼肌细胞摄取葡萄糖是维持血糖平衡的关键,摄取葡萄糖通过GLUT4转位到细胞膜完成。骨骼肌胰岛素抵抗是指胰岛素刺激骨骼肌摄取葡萄糖的能力减弱,导致持续的餐后高血糖。肌肉收缩能促进骨骼肌摄取葡萄糖,改善胰岛素敏感性。本课题组致力研究肌肉收缩促进骨骼肌葡萄糖摄取的分子机制,我们用过表达GLUT4HA的小鼠C2C12-GLUT4HA细胞株,采取电脉冲刺激的方法模拟运动造成的骨骼肌收缩,发现电刺激可以通过激活AMPK增加Rac1的活性,从而磷酸化Akt。Axin1是多功能的支架蛋白,含有与多种分子结合的位点或者结构域,参与了多种生理病理过程,Axin1可能参与到运动调节的AMPK信号通路。本研究用siRNA干扰技术在体外培养的骨骼肌细胞中沉默Axin1蛋白,探究Axin1在电刺激作用下调节Akt的分子机制。内容:第一部分:以3T3-L1脂肪细胞作为阳性对照,检测大鼠L6成肌细胞、小鼠C2C12-GLUT4HA肌管细胞和小鼠骨骼肌中Axin1蛋白的表达,检测电刺激对C2C12-GLUT4HA肌管细胞中Axin1蛋白表达的影响。第二部分:采用siRNA下调C2C12-GLUTHA细胞Axin1蛋白表达,检测基因沉默效果,研究siAxin1对电刺激条件下AMPK、PAK、Akt、AS160、PKC的磷酸化水平和Rac1活性的影响,细胞水平上研究AMPK和Axin1的相互关系。第三部分:喂养C57BL/6小鼠到12周龄,将小鼠随机分为对照组、胰岛素刺激组和跑台运动组,检测各组骨骼肌中Axin1的表达,动物实验中研究AMPK和Axin1的相互关系。方法:将小鼠C2C12-GLUTHA骨骼肌细胞分化成肌管细胞,用胰岛素或电脉冲刺激的方法刺激肌管细胞,免疫印迹法检测Axin1蛋白的表达。采用siRNA技术基因沉默Axin1,Western blot检测其对电刺激介导的C2C12-GLUT4HA细胞相关信号分子磷酸化水平变化的影响。12周龄的C57BL/6小鼠随机分为3组(1)无任何处理的空白对照组(2)腹腔注射胰岛素组(3)跑台运动组,免疫印记法测定各组Axin1的表达量,免疫共沉淀的方法测定运动下Axin1和AMPK相互作用。结果:第一部分结果显示:Axin-1在L6成肌细胞、C2C12-GLUT4HA肌管细胞和小鼠骨骼肌中均表达,并且电刺激C2C12-GLUT4HA肌管细胞显著升高Axin1的蛋白水平。第二部分结果显示:当用siRNA技术将C2C12-GLUTHA肌管细胞中Axin1基因沉默后,显著抑制电刺激C2C12-GLUT4HA肌管细胞后升高的AMPK、PAK、Akt和AS160信号分子的磷酸化水平、降低Rac1的活性,但对PKC的磷酸化水平无影响,Axin1和AMPK的免疫共沉淀作用在电刺激的作用下明显加强。第三部分结果显示:运动增加C57BL/6小鼠骨骼肌中Axin1的蛋白表达,并且增强Axin1和AMPK的免疫共沉淀作用。结论:Axin1可能通过与AMPK形成复合物从而诱导电刺激激活C2C12-GLUT4HA肌管细胞中的Akt,Axin1蛋白可作为改善和治疗胰岛素抵抗新靶点,有待进一步研究。