论文部分内容阅读
目的：研究RNAi技术对人肺癌A549细胞系中STAT3基因的阻断效应，应用荧光定量PCR法和Western-blot（蛋白免疫印迹法）检测干扰前后STAT3的表达情况，探讨STAT3在肺癌发病机制中的作用，为肺癌的治疗寻找新的靶点。方法：（1）化学合成siRNA并转染A549细胞：①以肺癌A549细胞作为靶细胞，STAT3基因作为靶基因，从CNKI上搜索STAT3mRNA全基因序列，BLAST软件进行同源性分析，以STAT3mRNA全基因序列作为模板，从基因编码区起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列，根据siRNA的设计原则，设计三段表达STAT3特异shRNA的基因序列，采用化学合成法合成三条双链siRNA，分别命名为sihSTAT3-1、sihSTAT3-2、sihSTAT3-3。将实验分为siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、sihGAPDH阳性对照组，NControl阴性对照组及A549细胞空白对照组。②采用脂质体介导方法，将合成siRNA转染各组细胞，16小时后荧光显微镜观察转染情况，观察转染效率。（2）荧光定量PCR法检测RNA干扰后STAT3mRNA抑制率：①以靶基因STAT3为目的基因、管家基因β-actin为内参基因。转染24h后收集细胞，用TRIZOL法提取RNA，逆转录成cDNA，琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。②于转染24h、48h、72h分别收集细胞，经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）获得靶基因STAT3及管家基因β-actin的cDNA产物，并作为标准品梯度稀释，采用SYBR GreenⅠ定量PCR检测，得出标准曲线，溶解曲线及扩增曲线。⑧采用相对定量比较域值法计算STAT3mRNA相对表达倍数，得出抑制率，进行统计学分析。（3）应用Western-blot法检测干扰后STAT3蛋白表达抑制率：①选择一干扰效率较高siRNA对各组中的STAT3蛋白进行Western-blot检测，用Bradford比色法测定蛋白含量、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、考马斯亮蓝染色观察蛋白条带、电转移（electrotransfer）封闭PVDF膜、免疫反应（加入一抗和二抗）、化学发光显示目的条带。②将Western-blot结果扫描传送至计算机，用Image-Proplus图像分析软件系统对蛋白条带进行分析，以蛋白条带的灰度值代表蛋白的表达量，用β-actin条带灰度值进行校正，得出各条带的相对灰度值。统计学分析结果。结果：（1）成功设计合成siRNA，并成功转染肺癌A549细胞。（2）荧光定量PCR结果显示，在转染24h、48h、72h后，各干扰组与空白组比较STAT3基因表达量明显下调（P<0.05），siRNA-STAT3对STAT3基因的表达均抑制，其中0到48小时抑制率呈明显上升趋势，48小时到72小时抑制率变化不明显。对应不同位点的三个siRNA-STAT3对STAT3mRNA表达的抑制率无明显差异（P>0.05）；阴性对照及空白对照STAT3表达量无明显差异（P>0.05）。（2）Western blot显示：转染前后STAT3蛋白的表达水平明显受到抑制，抑制率为76.92%，具有显著差异（P<0.05），内参基因在各组的表达量无明显差异。结论：（1）本实验利用化学合成法成功合成了针对STAT3基因的siRNA，成功建立了STAT3基因RNA干扰技术。（2）将合成的siRNA转染入A549细胞后，通过荧光定量PCR检测STAT3基因表达量，和通过Western-blot检测STAT3蛋白表达量，结果显示：转染后STAT3mRNA及蛋白表达量均明显受到抑制，而对内参基因的表达影响不大，说明合成的siRNA对STAT3有高效和特异的沉默作用。（3）本实验利用RNAi技术，有效地抑制肺腺癌A549细胞中STAT3基因的表达，诱导细胞凋亡。为进一步探索STAT3基因在肺癌发生发展中的重要作用奠定了基础，并为在肺癌的治疗中寻找更有效的靶点提供了方向