日本结缕草(Zoysia japonica Steud.)是一种具有极大应用潜力的草坪草,特别在我国,日本结缕草资源位居世界首位,它具有适合地域广、抗逆性强,低维护及发达的地下根系等特征,在现代城市绿化和运动场建设及水土保持中,都占有重要地位。但日本结缕草也有苗期生长缓慢、绿色期很短等缺点,尤其绿期短已经成为限制其大量应用的瓶颈。因此,本文对延长结缕草的绿期进行研究和探索,发现GA。(赤霉素)在缓解结缕草叶片衰老中的作用,并分离GA3调控叶片衰老相关基因,对于揭示赤霉素抗衰老机理,改良草坪草特性,缓解草坪草叶片衰老都具有重要的理论意义和实践价值。首先,选用从同一克隆分化而来的结缕草,进行黑暗诱导前的GA。喷施处理。结果发现黑暗可以有效诱导结缕草的叶片衰老,具体表现在叶绿素含量降低、可溶性糖含量升高、叶片细胞死亡的加剧,同时出现MDA的增加和H2O2的累积。然而,对于GA。喷施后的结缕草叶片,以上指标都出现了显著的改善,表现出缓解黑暗诱导的叶片衰老,并且由黑暗诱导引起的氧化伤害也明显的减少。这个结果说明,尽管GA3缓解结缕草叶片衰老的原因尚不明确,但是确定了GA。在结缕草叶片衰老中的负调控作用。为了深入研究GA3缓解结缕草叶片衰老的分子事件,寻找参与过程的功能基因,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以GA3喷施后黑暗处理的结缕草叶片的RNA为"tester",未经处理的RNA为"driver",构建参与GA3缓解黑暗诱导叶片衰老相关基因的差减cDNA文库,共筛选到22个与GA3缓解黑暗诱导衰老有关的基因。根据blast分析结果进行基因功能预测,可将这22个基因分为5类,包括：(1)基本代谢相关基因；(2)参与信号转导过程基因；(3)细胞骨架相关基因；(4)无相似性EST；(5)未知功能基因。根据候选基因的功能推测和前人有关叶片衰老的研究结果,选取了5个可能与GA。缓解黑暗诱导衰老有关的基因(AN—氨连接合成酶基因、V-ATPase-液泡膜上H-ATPas e基因、SAMs-S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因、CRY2-隐花色素2基因,OMT—-0-转甲基酶基因),采用RT-PCR技术分析了它们的时空表达模式(衰老的内部诱因)和外界胁迫(衰老的外部诱因)下的表达模式。从实验中初步发现,CRY2基因在幼嫩的叶片中上调表达,同时在外界胁迫的后期出现上调表达,并且在GA3和黑暗处理下出现了单因素上调表达,双因素下调表达的有趣调控模式。因此,认为CRY2基因是一个与叶片衰老最为相关的基因,并挑选其作为感兴趣的基因进行深入的功能分析。通过RACE-PCR技术扩增到CRY2基因的cDNA全长,对其编码的蛋白质氨基酸序列进行生物信息学分析,认为该基因属于隐花色素基因家族,它含有三个保守结构域：DNA光裂解酶,DNA光裂解酶FAD结合区和隐花色素C端,蓝光紫外光感受区域。同时,发现该基因与水稻的CRY2相似性最高；从进化关系上看,与玉米的CRY2的亲缘关系最近。因此,认为克隆到的基因为日本结缕草的ZjCRY2基因,通过对其进行生物信息学分析,发现其无信号肽及跨膜结构域,推测它是一个广谱表达而非膜定位的蛋白。由于前人没有报道CRY2基因与叶片衰老有关联,故利用拟南芥cry2突变体,从发育过程和黑暗诱导的叶片衰老这两个方面进行研究,证实CRY2基因参与调控自然发育过程中的叶片衰老进程。最后,为了对ZjCRY2基因的功能进行深入研究,并获得具有生产实践意义的抗衰老转基因结缕草,分别构建了ZjCRY2基因的过表达载体和RNAi敲除载体,对结缕草的胚性愈伤进行基因枪轰击转化。通过4个月的筛选继代,已经获得抗性愈伤,现在正在进行再生筛选,预计2个月之后获得转基因结缕草植株。综上所述,本文通过对GA。缓解黑暗诱导的结缕草叶片衰老现象进行深入的功能基因组学研究,发现了5个参与衰老调控的基因,并分析他们的表达模式,最后确定了其中CRY2基因参与GA3和黑暗作用下的衰老调控过程。利用RACE技术成功获得结缕草CRY2的全长cDNA序列,并且通过生物信息学的分析证明其是结缕草的ZjCRY2基因,并且利用拟南芥突变体cry2进行了功能预测。最后,构建了ZjCRY2基因的过表达和RNAi载体,并进行了转化,并即将获得转基因结缕草植株。因此,本研究的发现,将对未来结缕草抗衰老和园林植物叶片持绿的理论研究和生产应用奠定基础。