肿瘤坏死因子（TNF-a）主要由活化的T细胞、单核/巨噬细胞、NK细胞产生的具有多种生物学功能的细胞因子。它属于肿瘤坏死因子超家族成员，该家族成员虽然生物学功能各不相同，但它们蛋白质分子一级结构中的氨基酸序列的46-58、119-130、150-157等区域高度同源（高度保守结构域）；另外它们必须以同源三聚体形式与其相应受体结合才能介导生物学效应。因此，我们推测TNF超家族成员三聚体的形成可能和它们氨基酸序列中高度保守序列有关。本课题采用重叠PCR方法将TNF-a保守序列中的第58位异亮氨酸突变为酪氨酸（I58Y），第124位苯丙氨酸突变为丝氨酸（F124S），并将这2个TNF-a突变体分别亚克隆至pIREs-GFP-Xho1质粒，然后，将2个突变体重组质粒分别转染293T细胞，采用MTT法检测TNF-a突变体对MCF-7细胞的胞毒效应，为TNF-a分子结构和功能关系的深入研究提供线索，对TNF-a的基础研究及其临床应用具有重要的理论意义和实用价值。主要研究结果如下：　　 ⑴pcDNA3.0-TNF-a突变体重组质粒的构建，克隆及鉴定。①重组体的构建和克隆：以pcDNA3.0-wtTNF-a质粒为模板，用重叠PCR法定点突变58位（I58Y）、124位（F124S），用BamHI和XhoI对目的基因和 pcDNA3.0载体进行双酶切，并用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5a，通过其氨苄抗性挑选阳性克隆。②阳性克隆的鉴定：通过菌落PCR及上述限制性内切酶双酶切初步鉴定，筛选出阳性克隆，进一步DNA测序分析，证实点突变获得成功，仅在预计位点发生突变，其余核苷酸序列与野生型TNF-a序列相同。　　 ⑵pIREs-GFP-Xho1-TNF-a突变体重组质粒的构建，克隆及鉴定。将荧光载体pIREs-GFP-Xho1质粒用BglⅡ和XhoI进行顺序酶切，另外将上述2个突变体重组质粒（I58Y、F124S）和pcDNA3.0-wtTNF-a，用BamHI和XhoI进行双酶切，取前者酶切的大片段和后者小片段用T4连接酶连接，再转化入DH5a，通过卡那抗性挑选阳性克隆。以菌落PCR筛选阳性克隆。　　 ⑶MTT法检测野生型和各突变型TNF-a的细胞毒效应。将瞬时转染各突变型TNF-a和野生TNF-a的293T细胞作为效应细胞，以MCF-7为靶细胞，用MTT法比较其胞毒效应。结果显示I58Y、F124S的二个突变体的胞毒效应分别为13%和23%，其胞毒效应与野生型TNF-a相比明显降低，分别降低67%和57%。　　 研究表明：I58Y、F124S突变体可减弱MTNF-a的胞毒效应，提示TNF-a的58，124氨基酸可能与TNF-a三聚体的形成相关，该结论需要进一步检测TNF三聚体的形成能力来验证。本研究为TNF-a三聚体的研究提供依据和工具。