三株乳酸菌的鉴定及利用甜高粱秸秆汁发酵乳酸基础培养基的优化

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乳酸在材料化工、食品工业、医药工业等领域具有巨大的市场前景。乳酸的生产方法主要有化学法和生物法两种,生物法具有环境友好、生产原料来源丰富等优势。本论文以甜高粱秸秆汁为主要培养基质,通过乳酸菌发酵生产乳酸,以期为微生物发酵法生产乳酸提供实验依据。本文的主要研究内容包括:三株能利用甜高粱秸秆汁发酵乳酸的菌株鉴定、甜高粱秸秆汁的酶解优化、甜高粱秸秆汁基础培养基的优化以及利用高效液相色谱法对发酵产生的乳酸进行分析等四部分。主要研究结果如下:甜高粱秸秆汁的酶解优化:对甜高粱汁分别进行水浴酶解、超声水解和超声辅助酶解处理,得出超声辅助酶解处理的甜高粱汁转化率较其他两种处理高;其处理条件为:超声功率42.5 W,提取时间40 min,酶30 mg/L,提取温度43℃,其葡萄糖/蔗糖转化率可达(64.78±1.20)%。菌株鉴定:通过分子和生化鉴定的方法对三株乳酸菌进行鉴定;利用16SrDNA测序以及在基因库里进行比对分析,初步得出:A2菌种与Lactobacillus plantarum strain S4(植物乳杆菌S4)同源性较高;C2菌种与Lactobacillus fermentum strain KF3(发酵乳杆菌KF3)同源性较高;C3菌种与Lactobacillus sp.KLDS 1.0707(乳杆菌sp.KLDS 1.0707)同源性较高。通过革兰氏染色法得出结论:A2、C2、C3均为革兰氏阳性菌;将三种菌种分别接入固体培养基观察其是否有溶钙圈来判断其代谢产物是否为乳酸,实验可知:菌种A2、C2、C3均在固体培养基中产生了溶钙圈,初步判断它们的代谢产物为乳酸。利用乳酸菌成套生化鉴定管对三种菌种进行进一步的鉴定,发现三种菌种在麦芽糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、水杨苷溶液中的反应均呈阳性;扫描电镜结果得出三株乳酸菌形态都是杆状菌。基于以上分析得出:菌种A2被鉴定为Lactobacillus plantarum、C2被鉴定为Lactobacillus fermentum、C3被鉴定为Lactobacillus casel subsp.pseudoplantarum。基础培养基优化:通过原子吸收光谱法(AAS)和元素分析法(EA)对甜高粱汁的成分进行分析可知甜高粱汁缺乏蛋白胨、磷酸氢二钾以及硫酸锰三种有利于菌种发酵产乳酸的营养物质。通过响应面的BBD(Box-Behnken Design)设计,对加入三种营养物(蛋白胨、磷酸氢二钾以及硫酸锰)的甜高粱汁发酵培养基进行优化,获得三种菌株(编号A2、C2、C3)在不同的优化培养基中生产L型乳酸的产量及转化率。L.plantarum(编号A2)的最佳培养基组分为:甜高粱汁327.83g/L,蛋白胨1.67 g/L,磷酸氢二钾4.7 g/L,硫酸锰0.17 g/L。L.fermentum(编号C2)的最佳培养基组分为:338.67g/L高粱汁,3.33 g/L蛋白胨,5 g/L K2HPO4,0.033 g/L硫酸锰。L.casel subsp.pseudoplantarum(编号C3)的最佳培养基组分为:396.8 g/L甜高粱汁,3.33 g/L蛋白胨,3.33 g/L磷酸氢二钾,0.17g/L硫酸锰。三种菌种均在68 h左右时乳酸产量达到最大;其中,L.plantarum(编号A2)发酵生产乳酸产量为(110.66±2.46)g/L,L-乳酸的产量为(61.20±1.36)g/L,L-乳酸/葡萄糖转化率为(71.80±1.71)%,L-乳酸/蔗糖转化率达到(47.20±1.81)%;L.fermentum(编号C2)的L-乳酸/蔗糖转化率最大可达(52.45±2.05)%,L-乳酸/葡萄糖转化率为(95.74±1.45)%,对应的L-乳酸产量高达(66.89±2.69)g/L,乳酸量为(93.75±2.86)g/L;L.casel subsp.pseudoplantarum(编号C3)菌种的L-乳酸/蔗糖转化率为(49.90±2.25)%;L-乳酸/葡萄糖转化率为(91.46±2.18)%,乳酸产量(94.10±4.81)g/L,L-乳酸的产量可达(64.89±3.32)g/L。乳酸产率分析:利用高效液相色谱法对三种菌种产生的L-乳酸含量进行测定,可知L.plantarum(编号A2)产生的L-乳酸在总乳酸中的含量达55.74%;L.fermentum(编号C2)产生的L-乳酸在总乳酸中的含量达71.35%。L.casel subsp.pseudoplantarum(编号C3)产生的L-乳酸在总乳酸中的含量达68.95%。通过以上研究,发现三种菌种在新型的发酵培养基中都能高产乳酸,说明三种菌种在发酵乳酸中都具有良好的应用前景;且L.fermentum产生的L-乳酸在总乳酸中的含量最大,可达71.35%,说明菌种L.fermentum较L.plantarum、L.casel subsp.pseudoplantarum的产L-乳酸性能更优。
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