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番茄(Solanum lycopersicum)是一种典型的对温度十分敏感的蔬菜作物,在我国北方保护地栽培过程中经常受到低温及高温的伤害,造成落花落果,给菜农带来巨大的经济损失。作物产量有机物的95%以上都来自于光合作用。叶绿体不仅是光合作用的重要场所,而且对温度胁迫尤为敏感。在叶绿体中,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)和光系统II(PSII)核心蛋白D1是温度胁迫抑制作物光合能力并限制其生长发育的两个主要靶点。在温度胁迫下,叶绿体中卡尔文循环关键酶的活性降低,导致大量过剩光能的产生,造成光系统II的光抑制,从而降低番茄植株的光合能力。因此,挖掘温度胁迫下番茄光保护的相关基因并阐明其作用机制,对于温度敏感的蔬菜作物的抗逆栽培和育种都具有重要的科学意义和实践价值。我们从番茄低温诱导表达库中发现并鉴定了一个编码叶绿体和细胞核双定位SlWHIRLY1(SlWHY1)蛋白的基因。qRT-PCR、Western blot和GUS染色实验显示WHY1的转录和翻译水平均在低温诱导后上调。继而我们通过农杆菌介导的番茄叶盘转化获得了SlWHY1的过表达株系及RNAi株系。经低温处理(4°C)后,SlWHY1过表达株系较之野生型有着明显的耐低温表型,而其RNAi沉默株系的耐低温能力则低于野生型。电镜观察它们的叶绿体超微结构发现,与野生型相比,低温胁迫后SlWHY1过表达株系叶绿体的光合片层结构更完整、淀粉积累量更少,而其RNAi株系的光合片层结构受损更严重且淀粉量更多。转录组数据显示,编码PSII核心蛋白(D1蛋白)的PSBA基因以及两个淀粉代谢相关基因(ISA2和AMY3-LIKE)在SlWHY1过表达株系和野生型中的表达量有着明显的差异。因此,我们分别对叶绿体和细胞核中的WHY1蛋白的作用机制进行了分析。酵母单杂交、染色质免疫共沉淀及凝胶阻滞迁移实验证明,在叶绿体中,WHY1能够直接结合到PSBA编码区前的A/GTTACCCT/A区域来维持低温胁迫下PSBA的mRNA水平,增强D1蛋白的从头合成,从而保护了PSII。而细胞核中的SlWHY1能够直接结合到两个编码叶绿体定位的淀粉代谢相关酶ISA2和AMY3-LIKE基因的启动子的ERE元件上并调控其表达,在低温胁迫下降低叶绿体中淀粉的积累。以上结果表明,SlWHY1通过维持PSII的功能和降解淀粉来增强番茄对低温胁迫的抗性。Rubisco(由八个大亚基RBCL和八个小亚基RBCS组成)是碳同化过程中的限速酶且对低温胁迫尤为敏感。然而,目前尚不清楚植物如何在低温胁迫下维持Rubisco的含量。我们的研究发现,SlWHY1能够直接结合到SlRBCS1的启动子区域并激活其表达,从而在低温胁迫下维持Rubisco的水平。而SlRBCS1过表达株系较之野生型具有更高的Rubisco含量以及更强的低温抗性。这些结果表明,低温胁迫下过表达SlWHY1提高了SlRBCS1的含量及番茄植株的耐低温能力。qRT-PCR分析显示,在五个RBCS家族成员中,只有SlRBCS1的表达水平被低温诱导上调。SlRBCS1的氨基酸序列与其他RBCS家族成员的氨基酸序列具有高度的相似性(92.67%),且在其中仅发现了四个特异的氨基酸残基(R57、R105和NS113、114)。但在低温处理过程中,SlRBCS1中这些特异氨基酸的替换并不会影响其耐低温的能力。因此,我们认为在番茄低温胁迫中起重要作用的是SlRBCS1的表达水平,而不是其的特异氨基酸残基。总之,在农业生产中,提高WHY1的表达量可作为增强冷敏感作物低温抗性的有效策略之一。热激转录因子(HSF)对热激蛋白(HSP)的调控是植物应对高温胁迫的主要防御反应之一。我们在研究中发现,SlWHY1同样能受到高温的诱导。在经过高温处理后,SlWHY1过表达植株比野生型萎蔫程度更低,具体表现在它具有更好的膜稳定性,更高的可溶性糖含量以及更少的活性氧(ROS)积累。而SlWHY1 RNAi株系在高温胁迫下表现出与其过表达植株相反的表型和生理变化。进一步分析发现,一个编码内质网定位的小分子热激蛋白基因SlHSP21.5A的表达量在SlWHY1过表达植株中上调,而在其RNAi植株中下调。具体研究表明,S1WHY1能够结合到S1HSP21.5A的启动子上的ERE-like元件并激活其表达。此外,SlHSP21.5A的RNAi植株经高温处理后,其膜稳定性和可溶性糖含量均低于野生型而活性氧积累量远高于野生型。这些结果表明,SlWHY1可以通过提高SlHSP21.5A的表达来增强番茄的耐热性。