随着畜牧业的可持续发展，我国蛋白质饲料持续短缺，新型蛋白质饲料资源的开发变得越来越紧迫。新型蛋白质饲料的开发技术主要是利用现代生物技术将一些利用率低的饲料资源或非常规饲料资源变为新型蛋白饲料，提高其利用率。现代生物技术在开发利用新型蛋白质饲料方面主要应用发酵工程技术生产发酵饲料、酶工程技术生产酶解饲料等。无论是发酵工程技术还是酶工程技术都涉及微生物资源或微生物酶资源的开发与利用。利用发酵技术或酶技术在以羽毛粉为对象开发新型蛋白质饲料的过程中筛选各种细菌、真菌和放线菌。其中细菌以芽孢杆菌属细菌居多，该菌属细菌多数产碱性蛋白酶，已有大量的碱性蛋白酶被开发应用于各种工业生产。目前，在羽毛角蛋白降解方面还仅处于酶的分离与纯化的研究，如何采用基因工程技术提高酶的产量是当今的研究热点。本试验在本实验室前期微生物菌种资源筛选的基础上对比研究血红蛋白降解菌短小芽孢杆菌NJM4和角蛋白降解菌短小芽孢杆菌WHK产蛋白酶性质，从中选取产蛋白酶活力较高的WHK4菌株作为研究素材，对其蛋白酶进行分离纯化，并对蛋白酶的酶学性质进行了研究，深入了解该酶的特性，为今后的开发利用奠定理论基础。同时对于如何提高NJM4的产酶能力本试验采用基因重组的方式研究碱性蛋白酶基因在大肠杆菌和短小芽孢杆菌中的表达。试验分为以下6个部分：　　 试验一、短小芽孢杆菌NJM4与WHK4生物学特性的比较研究　　 系统地比较研究了短小芽孢杆菌-NJM4与WHK4生物学的差异，分析两者产蛋白酶差异的原因。首先比较两者的培养、生理生化特性，然后比较分析了两者在相同培养基内对产蛋白酶活力及其对不同底物活力的影响。在基因水平上比较了两者碱性蛋白酶基因以及该基因上游启动子区域的基因序列。结果显示：两者生理生化特性无差异，在培养特性方面则有差异，WHK4的生长速度较快，在相同的培养基中24 h内产生芽孢，而NJM4在相同的时间内未形成芽孢；在产酶方面，WHK4在血红蛋白和羽毛粉发酵培养基内产蛋白酶活力高于NJM4，在营养丰富的LB培养基中产蛋白酶活力却低于NJM4。分别以不同底物测定的蛋白酶活力WHK4均高于NJM4。在基因水平上两者碱性蛋白酶基因1152bp的碱基中虽然只有一个碱基不同，但其对应的密码子所编码的氨基酸属同一个氨基酸，启动子区域49bp的基因序列完全相同。试验表明WHK4较NJM4产酶能力强，酶活力高，是产蛋白酶的优良菌株。　　 试验二、短小芽孢杆菌WHK4以羽毛粉为底物产蛋白酶条件的优化　　 探索WHK4以羽毛粉为底物产酶的最佳条件和最佳培养基组成。以羽毛粉发酵培养基为基础，首先采用单因子试验研究底物浓度、初始pH、接种量、外加碳源、外加氮源对WHK4产酶活力的影响。在单因子试验的基础上采用正交试验设计对底物浓度、温度、初始pH、接种量、外加(NH4)2SO4、外加麦芽糖进行优化。结果显示：WHK4最佳的产酶条件为初始pH7.38，菌龄16 h，接种量5％，37℃。最佳的培养基组成为：1L基础发酵培养基，40.0 g羽毛粉，10.0 g(NH4)2SO4和10.0 g麦芽糖。在优化的条件下WHK424 h产蛋白酶活力为90 U·mL-1。WHK4培养条件及培养基的优化为其产蛋白酶的分离纯化奠定了基础。　　 试验三、短小芽孢杆菌WHK4蛋白酶的分离、纯化及酶学特性的研究　　 为得到WHK4酶的纯品，更好的了解该酶的酶学特性，本试验在优化的产酶条件下首先制备粗酶液，然后采用50％饱和硫酸铵盐析，沉淀用1/10体积的PBS溶液溶解后透析除盐，经Sephdex G-100凝胶过滤层析分离出蛋白酶。对所得的蛋白酶进行SDS-PAGE酶谱分析，测定酶最适作用温度和pH，对酶学特性进行测定。结果显示：WHK4以羽毛粉为底物发酵液中含有两种蛋白酶，其中一种蛋白酶分子量约为50 KD，该酶作用最适温度为60℃，最适pH为8.5，Fe3+、Cu2+、SDS、EDTA对蛋白酶活力有较强的抑制作用，Ba2+、Ca2+、Mg2+和Fe2+以及有机溶剂DMSO、异丙醇、甘油，表面活性剂TritonX-100对蛋白酶活力几乎无影响。表明该酶属于金属蛋白酶，在耐有机溶剂生物催化剂方面有潜在的应用前景，在洗涤工业生产中也有较大的应用价值。　　 试验四、短小芽孢杆菌NJM4碱性蛋白酶基因的表达与活性分析　　 为提高碱性蛋白酶的产酶量，本试验研究其在大肠杆菌中的表达。采用同源克隆的方法设计碱性蛋白酶基因扩增引物，用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，然后将扩增的PCR产物和克隆载体pUC57经XbaI和BamHI双酶切后连接构建pUC57-AP，转化TOP10感受态细胞，涂布LB/Amp/X-gal/IPTG培养基平板，挑选白色菌落进行PCR鉴定，然后测序分析。将PCR产物和表达载体pET-28b经NcoI和BamHI双酶切后连接构建pET-28b-AP，转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB/Kan/酪蛋白培养基平板，挑选有水解圈的阳性克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆用IPTG诱导4 h后测定发酵液的蛋白酶活力。结果表明，克隆得到的NJM4碱性蛋白酶基因全长为1152 bp，编码383个氨基酸，成熟肽276个氨基酸。从LB/Kan/酪蛋白平板培养基筛选有透明水解圈的菌株，命名为BL21(DE3)-28b-AP。该菌株经IPTG诱导后发酵上清液蛋白酶活力为不含重组子菌株的37.3倍。成功地构建具有蛋白酶活力的高效表达的菌株为碱性蛋白酶的批量生产奠定了基础。　　 试验五、短小芽孢杆菌NJM4原生质体转化研究　　 探索短小芽孢杆菌原生质体的形成条件及其转化的可行性。采用溶菌酶脱壁制备原生质体，进行单因子试验，显微镜观察酶的浓度、作用温度，酶解时间对原生质体形成率的影响。在最适宜的条件下制备原生质体，在Ca2+的环境中用PEG6000诱导pUC57-AP重组质粒的转化，采用含氨苄青霉素的DM3培养基平板筛选转化子。结果显示，用含氨苄青霉素的DM3培养基平板筛选的转化子经含氨苄青霉素的液体培养基培养后其蛋白酶的活力几乎丧失。表明短小芽孢杆菌NJM4&于原生质体化，可以实现外源质粒转化，是一株潜在的基因工程受体菌。　　 试验六、分光光度计法检测原生质体形成过程的初步研究　　 探索芽孢杆菌原生质体形成过程中光密度的变化与原生质体形成率之间的关系。采用分光光度计测定原生质体形成过程中溶液的OD60nm，同时采用镜检计数测定原生质体形成率，分别绘制光密度变化曲线和原生质形成曲线，采用SPSS统计软件中CurveEstimation分析两者之间的相关性并进行曲线拟合。结果显示：原生质体溶液光密度的变化和原生质体的形成率之间存在显著的相关性(R2=0.985，P<0.01)，随着原生质体形成率的增加溶液光密度逐渐减小，两者之间呈负相关，3次多项式曲线拟合最佳(Y=0.746-0.01t+1.83×10-4t2-1.171×10-6t-3)。表明原生质体形成过程中通过动态监测原生质体溶液光密度的变化可实现原生质体形成率的定量分析。