研究背景:原发性肝癌为世界范围内最常见恶性肿瘤之一。原发性肝癌,有多种分类方式,其中按照组织学类型可以划分为3型,即肝细胞型、胆管细胞型以及混合型。肝癌的发病中,以肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最常见,占原发性肝癌发病率的90%,属于肝细胞型,简称肝癌。2015年我国恶性肿瘤流行情况分析显示,肝癌在我国恶性肿瘤发病中排名第4位,发病率达26.92/10万,新发病例约37.0万例;死亡率位居我国恶性肿瘤死亡第2位,死亡病例为32.6万例。尽管目前肝癌患者的生存率较过去已经大大升高,但对中晚期患者的治疗效果依然不理想。同时,由于肝癌具有高复发率,因此也给患者的生存带来了极大的影响。我国肝癌的发病率在近二十年来呈逐渐上升趋势,且患病人群逐渐向低龄化发展,因此亟待寻找新的有效的诊断和治疗的方法。目前临床上肝癌的治疗手段主要为手术切除、肝移植、放疗等,其中根治性手术切除依然占据主要地位。但根治性手术后依然存在较高的复发率,这主要与肝癌的生物学特性相关。肝癌细胞的异常增殖以及细胞黏附因子的大量生成,导致肝癌细胞进入血液和周围组织器官,越来越多肝癌细胞在其他组织器官中停留和增殖,给其自身的生长提供了有利的微环境,最终引起肝癌的复发。根据当前的研究结果提示,肿瘤的发生与恶性进展是多种因素共同作用的结果,如细胞侵袭正常组织、分化异常、增殖不受制约、异常转移、细胞周期阻滞和凋亡紊乱等。也正因如此,为开发肝癌治疗的新手段,我们可以在肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、细胞周期等方面进行深入的研究。桥粒芯糖蛋白(Desmogleins,DSG)与桥粒蛋白(Desmocollins,Dsc)为一组跨膜蛋白,在构成细胞间桥粒的糖蛋白中占据重要位置,属于细胞钙黏附素家族成员,具有介导细胞间黏附的作用,在黏膜上皮细胞间的黏附过程中发挥着重要的作用。DSG包括4种亚型,其中DSG2为分布最广的亚型。DSG2是位于细胞表面的一种黏附蛋白,属于钙粘蛋白家族成员,在人类机体中所有单层上皮细胞以及含有桥粒的组织中均能检测到其表达。在DSG家族中,仅DSG2出现高水平内源性表达。研究发现,DSG2在多种人类恶性肿瘤中呈高表达状态,其中包括皮肤癌、结直肠癌、肺癌等。另有研究表明,DSG2在胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等恶性肿瘤的表达则发生显著下调。上述研究结果表明,DSG2在不同组织来源的恶性肿瘤中的表达水平发生上调或下调,发挥着癌基因或抑癌基因的作用。亦有研究表明DSG2在机体细胞增殖分化以及恶性转化等过程中扮演着重要角色,同时还与肿瘤的侵袭性生长和转移有关。然而,DSG2基因在肝癌中的表达情况及其与原发性肝癌发生发展的关系尚未见报道,探索肝癌进展中DSG2基因的作用及可能的机制对肝癌的基础研究具有重要意义,为此我们设计了此实验以明确其功能及作用机制以便为肝癌患者的生物治疗提供治疗靶点。第一部分DSG2在肝细胞癌中的表达及其临床意义目的:旨在研究DSG2在肝癌组织及细胞系中表达情况,进一步分析其与肝癌患者临床病理参数以及生存期的关系。方法:对收集的104对肝癌组织以及癌旁正常组织行免疫组化染色、实时定量PCR(qRT—PCR)及免疫印迹(Westertrn blot),检测DSG2在不同组别中的表达情况并进行统计学分析。采用实时定量PCR法检测DSG2mRNA在正常肝细胞系(HL-7702)及肝癌细胞系(QGY-7404、Bel-7402)中的表达情况,western blot法验证DSG2蛋白在细胞系中的表达。然后将DSG2与肝癌患者临床病理学资料进行相关性分析,同时分析DSG2蛋白表达与临床预后的关系。结果:1.通过免疫组化染色、实时定量PCR(qRT—PCR)及免疫印迹(Western Mot)等方法检测发现,DSG2在HCC癌组织中的表达量显著高于癌旁非癌组织。(P<0.05)。2.DSG2在HCC细胞系中的表达显著高于正常肝细胞系(HL-7702细胞系)中的表达(P<0.05)。3.根据免疫组化评分结果我们将组织样本分为高表达DSG2组(n=68)和低表达DSG2组(n=36),DSG2的表达与肿瘤大小(P=0.039)、AFP(P=0.037)和肿瘤分期(P=0.020)相关。4.DSG2高表达肝癌患者的OS明显短于DSG2低表达者(P=0.036)。5.单变量分析结果显示,DSG2表达(P=0.027)、AFP、肿瘤大小(P=0.037)和肿瘤分期(P=0.025)对肝癌患者的OS具有显著影响;而年龄、性别、HBsAg、吸烟情况则与肝癌患者的OS无关(P>0.05)。6.采用Cox 比例风险分析单变量分析中存在显著性的变量进行多变量分析,结果表明DSG2表达(P=0.021)、肿瘤大小(P=0.032)和肿瘤分期(P=0.019)均是OS的独立预后因素。结论:1.DSG2在肝癌组织及肝癌细胞株中高表达,且与肝癌患者的肿瘤分期、AFP以及肿瘤大小有关;2.DSG2高表达的肝癌患者的总生存期明显短于DSG2低表达者,是判断肝癌患者预后的独立因素;第二部分DSG2在肝细胞癌中的生物功能及机制的初步研究目的:本研究通过体外细胞实验探讨DSG2表达抑制对肝癌细胞增殖、克隆形成、凋亡等生物功能的影响;并对该进程中产生作用效应的机制进行初步探讨,意在为寻求有效治疗肝癌的新方式奠定基础。方法:采用CCK-8法检测肝细胞系HL-7702和肝癌细胞系(QGY-7404和Bel-7402)的增殖活性。应用siRNA技术沉默肝癌细胞株QGY-7404和Bel-7402中DSG2的表达,每种细胞随机分为2组,分别为NC siRNA组和si-DSG2组。使用RT—PCR及western blot检测转染后两组细胞株中DSG2mRNA及其蛋白表达水平的变化情况,并与空载体对照组进行相应的比较。通过体外细胞功能实验:CCK-8检测实验、细胞克隆形成检测、流式细胞术检测,阐明DSG2基因对肝癌细胞增殖、克隆形成、凋亡能力的影响。使用Western blot法分别检测QGY7404/DSG2-siRNA细胞、Bel-7402/DSG2-siRNA细胞及空白转染的对照组细胞中β-catenin、c-myc的表达水平,并进行比较。结果:1.CCK-8检测结果表明,与HL-7702细胞相比,QGY-7404和Bel-7402细胞在第1、2、3天时的增殖活性均有所升高,其中在第3天时增殖活性存在显著差异。2.转染后各组肝癌细胞中DSG2 mRNA和蛋白表达量显著下降(P<0.01)。3.CCK-8检测结果提示DSG2基因沉默组与NC siRNA组相比,细胞增殖能力减弱,在第3天时的增殖活性与NC siRNA组相比存在显著差异(P<0.01)。4.细胞克隆形成能力检测提示,相对于空白转染组,DSG2基因沉默组细胞克隆形成数量明显减少。(P<0.01)5.DSG2沉默表达的QGY-7404和Bel-7402细胞的凋亡率较对照组无明显差异。(P>0.05)6.QGY7404及Bel-7402肝癌细胞系中,DSG2沉默组较对照组β-catenin及c-myc的表达均明显减低。结论:1.沉默DSG2基因可抑制肝癌细胞增殖,并抑制肝癌细胞克隆形成,对凋亡无明显影响;2.DSG2可能是通过调控Wnt/β-catenin信号进而调节肝癌细胞增殖。