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研究背景：
创伤、肿瘤切除，感染、先天原因等造成的骨缺损，尤其是发生在颅颌面部的骨缺损，可引起患者面部的畸形，咬合和咀嚼功能障碍，严重影响患者的生活质量和心理健康。虽然目前组织工程骨已经在骨缺损修复重建的研究领域取得了一定的研究成果，但多是应用于小段骨不承重的部位或腔隙的填充，对于大段骨的缺损修复重建主要还是以自体骨移植为主，但其局限性日益显现。随着组织工程骨的不断发展，特别是3D打印的新型可降解的生物玻璃陶瓷可模拟骨的微观结构并且具有骨引导和骨诱导的特性，为大段骨的修复重建提供了一种新的方法。
研究目的：
通过构建内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)复合3D打印个性化生物玻璃陶瓷(AP40mod)用于兔下颌骨极限缺损的修复重建，探索新材料应用于复杂大段骨缺损修复重建的可能性，以期为临床上大段骨缺损修复重建提供一种新的方法。
研究方法：
1.采用密度梯度离心法获得兔BMSCs，通过观察细胞的形态、生长方式、表面抗原的检测、多功能方向的分化来鉴定细胞。
2.采用密度梯度离心法联合差速贴壁法，在内皮细胞培养基诱导的特殊条件下进行提取、分离和培养兔EPCs。通过连续观察细胞形态、检测细胞表面抗原、吞噬Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力以及体外成管腔样结构的能力来鉴定细胞。
3.3DP和DLP两种打印方式打印AP40mod，利用扫描电镜观察表面结构以及四点弯曲实验来判定哪种打印方式更有利于提高材料的机械强度。
4.将EPCs和BMSCs以不同比例混合进行直接共培养，筛选两者共培养的最佳比例。首先根据CCK-8检测法进行初步筛选，然后将初筛的细胞比例直接接种到AP40mod上，通过碱性磷酸酶活性、成骨和成血管相关基因表达情况来进一步筛选出最佳的共培养比例。
5.分别用红色荧光慢病毒(eRFP)感染EPCs，绿色荧光慢病毒(eGFP)感染BMSCs，使两种细胞分别携带红色荧光蛋白标记和绿色荧光蛋白标记，然后将两者以最佳的比例接种到AP40mod上，利用旋转生物反应器进行动态培养1周后，扫描电镜观察细胞接种后的形态变化；利用小动物活体成像技术以及冰冻切片技术观察植入裸鼠皮下1月后，植入细胞的生存和迁移情况。
6.利用Micro-CT扫描实验兔的下颌骨，重建下颌骨模型后，设计右侧下颌骨缺损范围(下颌第一前臼齿近中至下颌第二后臼齿近中，10.70×9.91×6.37mm)，利用西安交通大学机械工程学院自主研发设计的光固化打印系统进行AP40mod的个性化打印。
7.新西兰大白兔右侧下颌骨作为大段骨缺损的实验对象，将个性化的AP40mod组和EPCs/BMSCs/AP40mod组分别植入对应下颌骨缺损处，空白对照组截去相应的下颌骨后不做任何处理。分别在术后1、3、6和9月进行大体观察、X线、Micro-CT扫描并行HE和Masson染色，以此来评价缺损区修复重建效果。
研究结果：
1.提取、分离培养兔BMSCs的形态为长梭形，原代细胞以集落式生长为主，传代后以漩涡式生长为主；CD29，CD90阳性表达，CD34，CD45阴性表达，具有成骨和成脂方向分化的能力。
2.提取、分离培养兔EPCs的早期形态为不规则性，培养一周后，细胞呈现铺路石样；CD133，VEGFR2呈阳性表达；具有吞噬Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力；体外基质胶内培养6h后就有明显的管腔样结构出现，一周之后相互连接成脉管样的结构。
3.扫描电镜显示3DP打印的AP40mod颗粒之间结合松散，而DLP打印的相对致密；四点弯曲实验结果显示DLP打印的机械强度是52.6Mpa，相比于3DP打印的17.5MPa具有明显的统计学差异(p＜0.01)。
4.在选择以何种比例进行两种细胞共培养的实验中，EPCs：BMSCs以2:1的比例混合接种后，成骨和成血管相关基因以及ALP的活性的结果明显优于其他组，因此选择2:1作为后续实验的细胞比例。
5.带荧光标记的EPCs/BMSCs(2:1)接种到AP40mod上后，扫描电镜结果显示细胞紧密的粘附在材料表面，细胞形态正常，生长良好；植入裸鼠皮下后，活体扫描和冰冻切片均显示细胞生存良好并且发生了迁移。
6.个性化设计的AP40mod以及在复合EPCs/BMSCs(2:1)后，植入兔的下颌骨极限缺损区，术后大体观察、X线和Micro-CT均显示植入物与缺损区匹配良好，复合细胞组在术后9个月的时间内降解了29.986%相比于单独材料组(20.081%)具有明显的统计学差异(p＜0.01)。
7.空白对照组在整个观察期内，缺损始终没有完全愈合并且在术后9月和12月的缺损面积没有统计学差异(13.1%±0.032；11.3%±0.036，P＞0.05)，说明保留下颌牙齿的极限缺损模型是成功的。实验组的组织学结果显示复合组和单独组的材料内部孔隙具有明显的血管新生，并且在血管周围存在着大量的新生胶原，随着植入时间的延长而越来越接近成熟，但复合组新生血管的量、骨髓和胶原的成熟度都明显优于单独组。
研究结论：
1.一步法可以便捷、高效获得纯度较高的EPCs和BMSCs。
2.EPCs与BMSCs按照2:1比例与AP40mod进行共培养，可明显促进细胞增殖活性和ALP的活性表达以及成骨、成血管相关基因的表达。
3.EPCs/BMSCs可以在AP40mod表面及内部紧密贴附生长，在动物体内可以正常生存并迁移。
4.3D打印可降解的，个性化AP40mod复合EPCs/BMSCs可用于兔下颌骨极限缺损的修复重建，为应用于临床提供了理论基础和实验依据。
创伤、肿瘤切除，感染、先天原因等造成的骨缺损，尤其是发生在颅颌面部的骨缺损，可引起患者面部的畸形，咬合和咀嚼功能障碍，严重影响患者的生活质量和心理健康。虽然目前组织工程骨已经在骨缺损修复重建的研究领域取得了一定的研究成果，但多是应用于小段骨不承重的部位或腔隙的填充，对于大段骨的缺损修复重建主要还是以自体骨移植为主，但其局限性日益显现。随着组织工程骨的不断发展，特别是3D打印的新型可降解的生物玻璃陶瓷可模拟骨的微观结构并且具有骨引导和骨诱导的特性，为大段骨的修复重建提供了一种新的方法。
研究目的：
通过构建内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)复合3D打印个性化生物玻璃陶瓷(AP40mod)用于兔下颌骨极限缺损的修复重建，探索新材料应用于复杂大段骨缺损修复重建的可能性，以期为临床上大段骨缺损修复重建提供一种新的方法。
研究方法：
1.采用密度梯度离心法获得兔BMSCs，通过观察细胞的形态、生长方式、表面抗原的检测、多功能方向的分化来鉴定细胞。
2.采用密度梯度离心法联合差速贴壁法，在内皮细胞培养基诱导的特殊条件下进行提取、分离和培养兔EPCs。通过连续观察细胞形态、检测细胞表面抗原、吞噬Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力以及体外成管腔样结构的能力来鉴定细胞。
3.3DP和DLP两种打印方式打印AP40mod，利用扫描电镜观察表面结构以及四点弯曲实验来判定哪种打印方式更有利于提高材料的机械强度。
4.将EPCs和BMSCs以不同比例混合进行直接共培养，筛选两者共培养的最佳比例。首先根据CCK-8检测法进行初步筛选，然后将初筛的细胞比例直接接种到AP40mod上，通过碱性磷酸酶活性、成骨和成血管相关基因表达情况来进一步筛选出最佳的共培养比例。
5.分别用红色荧光慢病毒(eRFP)感染EPCs，绿色荧光慢病毒(eGFP)感染BMSCs，使两种细胞分别携带红色荧光蛋白标记和绿色荧光蛋白标记，然后将两者以最佳的比例接种到AP40mod上，利用旋转生物反应器进行动态培养1周后，扫描电镜观察细胞接种后的形态变化；利用小动物活体成像技术以及冰冻切片技术观察植入裸鼠皮下1月后，植入细胞的生存和迁移情况。
6.利用Micro-CT扫描实验兔的下颌骨，重建下颌骨模型后，设计右侧下颌骨缺损范围(下颌第一前臼齿近中至下颌第二后臼齿近中，10.70×9.91×6.37mm)，利用西安交通大学机械工程学院自主研发设计的光固化打印系统进行AP40mod的个性化打印。
7.新西兰大白兔右侧下颌骨作为大段骨缺损的实验对象，将个性化的AP40mod组和EPCs/BMSCs/AP40mod组分别植入对应下颌骨缺损处，空白对照组截去相应的下颌骨后不做任何处理。分别在术后1、3、6和9月进行大体观察、X线、Micro-CT扫描并行HE和Masson染色，以此来评价缺损区修复重建效果。
研究结果：
1.提取、分离培养兔BMSCs的形态为长梭形，原代细胞以集落式生长为主，传代后以漩涡式生长为主；CD29，CD90阳性表达，CD34，CD45阴性表达，具有成骨和成脂方向分化的能力。
2.提取、分离培养兔EPCs的早期形态为不规则性，培养一周后，细胞呈现铺路石样；CD133，VEGFR2呈阳性表达；具有吞噬Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力；体外基质胶内培养6h后就有明显的管腔样结构出现，一周之后相互连接成脉管样的结构。
3.扫描电镜显示3DP打印的AP40mod颗粒之间结合松散，而DLP打印的相对致密；四点弯曲实验结果显示DLP打印的机械强度是52.6Mpa，相比于3DP打印的17.5MPa具有明显的统计学差异(p＜0.01)。
4.在选择以何种比例进行两种细胞共培养的实验中，EPCs：BMSCs以2:1的比例混合接种后，成骨和成血管相关基因以及ALP的活性的结果明显优于其他组，因此选择2:1作为后续实验的细胞比例。
5.带荧光标记的EPCs/BMSCs(2:1)接种到AP40mod上后，扫描电镜结果显示细胞紧密的粘附在材料表面，细胞形态正常，生长良好；植入裸鼠皮下后，活体扫描和冰冻切片均显示细胞生存良好并且发生了迁移。
6.个性化设计的AP40mod以及在复合EPCs/BMSCs(2:1)后，植入兔的下颌骨极限缺损区，术后大体观察、X线和Micro-CT均显示植入物与缺损区匹配良好，复合细胞组在术后9个月的时间内降解了29.986%相比于单独材料组(20.081%)具有明显的统计学差异(p＜0.01)。
7.空白对照组在整个观察期内，缺损始终没有完全愈合并且在术后9月和12月的缺损面积没有统计学差异(13.1%±0.032；11.3%±0.036，P＞0.05)，说明保留下颌牙齿的极限缺损模型是成功的。实验组的组织学结果显示复合组和单独组的材料内部孔隙具有明显的血管新生，并且在血管周围存在着大量的新生胶原，随着植入时间的延长而越来越接近成熟，但复合组新生血管的量、骨髓和胶原的成熟度都明显优于单独组。
研究结论：
1.一步法可以便捷、高效获得纯度较高的EPCs和BMSCs。
2.EPCs与BMSCs按照2:1比例与AP40mod进行共培养，可明显促进细胞增殖活性和ALP的活性表达以及成骨、成血管相关基因的表达。
3.EPCs/BMSCs可以在AP40mod表面及内部紧密贴附生长，在动物体内可以正常生存并迁移。
4.3D打印可降解的，个性化AP40mod复合EPCs/BMSCs可用于兔下颌骨极限缺损的修复重建，为应用于临床提供了理论基础和实验依据。