【摘 要】
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高温是影响夏季畜牧生产最主要的应激源之一,可引起畜禽肠道黏膜萎缩,破坏肠道上皮屏障。高温造成的肠上皮稳态失衡可能与其再生过程发生紊乱有关,而肠上皮细胞的再生来源于
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高温是影响夏季畜牧生产最主要的应激源之一,可引起畜禽肠道黏膜萎缩,破坏肠道上皮屏障。高温造成的肠上皮稳态失衡可能与其再生过程发生紊乱有关,而肠上皮细胞的再生来源于肠道干细胞,并受干细胞微环境中Wnt/β-catenin信号通路的调控。为研究热暴露对猪肠上皮更新进程的影响,本试验借助猪空肠上皮细胞系IPEC-J2(porcine jejunal epithelial cell),运用MTT法、细胞计数法检测热暴露(41℃)对细胞增殖的影响,并在增殖的差异时间点通过Western blotting、细胞免疫荧光、流式细胞术、transwell检测细胞凋亡、细胞分化、细胞屏障功能和Wnt/β-catenin信号通路的变化;同时分离5日龄二元杂公猪空肠隐窝,利用三维立体培养的类肠团(enteroid)模型,研究热暴露(41℃)对类肠团形成和扩增的影响,并运用RT-PCR、Wes和类肠团免疫荧光检测增殖、凋亡、分化标志及β-catenin和紧密连接蛋白变化。本研究为高温条件下肠道损伤及其修复提供新的靶标和策略。试验结果如下:(1)41℃热暴露48 h和72 h可显著抑制IPEC-J2细胞增殖(P<0.05)和类肠团形成,热暴露24 h降低类肠团出芽指数(P<0.05),下调细胞增殖标志PCNA/Ki67表达水平(P<0.05),增加热休克蛋白HSP70蛋白质表达(P<0.05);(2)41℃热暴露72 h可显著诱导IPEC-J2细胞凋亡(P<0.05),增加Caspase-3蛋白质表达(P<0.05)。热暴露24 h,类肠团Caspase-3蛋白质表达显著增加(P<0.05);(3)41℃热暴露72 h或24 h可分别显著抑制IPEC-J2细胞和类肠团分化,降低终末分化标志(KRT20)、干细胞标志(Lgr5、Bmi1)、吸收细胞标志SI和杯状细胞标志Muc2表达水平(P<0.05);(4)41℃热暴露72 h可显著降低IPEC-J2细胞TEER值(P<0.05),增加荧光素钠(FS)通透性(P<0.05),减少紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin和Claudin-1)表达水平(P<0.05),损伤细胞屏障。41℃热暴露24 h也可显著降低类肠团中紧密连接蛋白表达(P<0.05);(5)热暴露可显著抑制Wnt/β-catenin信号通路,上调Axin2、GSK3β蛋白质表达(P<0.05),下调β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白质表达(P<0.05);结论:Wnt/β-catenin信号通路介导热暴露抑制猪肠上皮细胞增殖、分化,促进细胞凋亡,阻碍类肠团形成和扩增,最终导致肠上皮屏障功能受损。
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