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研究目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性疾病,易损斑块破裂、血栓形成是脑卒中发病的主要机制。近年来研究发现,在AS的发生、发展和血栓性并发症形成过程中,炎症始终为其关键因素,巨噬细胞在这一过程中发挥重要作用。巨噬细胞自噬(autophagy)是一种存在于真核细胞内高度保守的清除入侵微生物、变性长寿命蛋白和受损细胞器的降解过程。已有大量研究表明,自噬可以抑制炎性小体的激活甚至包裹炎性小体主要成分再与溶酶体而将其降解,从而在多种疾病中发挥抗炎、治疗作用。褐藻糖胶(fucoidan)是从海藻中提纯的以L-岩藻糖为基础的硫酸化多糖,具有多种药理特性,包括抗病毒,抗肿瘤作用,降低血脂,抑制血管形成,并且能够调节来自巨噬细胞的炎症因子释放。基于以上研究,本课题重点通过构建ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化易损斑块模型和体外泡沫细胞模型,从动物整体水平及细胞水平探讨褐藻糖胶的抗AS作用及其分子机制。研究方法:1.动物实验:通过给予ApoE-/-小鼠右侧颈动脉套环并高脂饮食喂养,建立颈AS模型,应用褐藻糖胶干预,观察小鼠血脂水平,颈动脉斑块形成情况,并检测NLRP3炎性小体和自噬相关蛋白表达。(1)将36只6周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为3组,每组12只,即对照组,模型组,褐藻糖胶组。对照组不做处理,余2组小鼠在2周的适应性喂养后逐步过渡到高脂饮食(含0.25%的胆固醇和15%脂肪),8周龄时,右颈总动脉插入硅胶环,诱导所有ApoE-/-小鼠颈AS斑块的形成。对照组小鼠普通饮食,另2组小鼠均予以高脂饮食连续喂养8周,褐藻糖胶组给予60mg/kg腹腔注射。(2)异氟烷麻醉后取内眦动脉血1-2ml,检测小鼠血清中三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白(HDL-c)的含量。(3)形态学观察:套管侧颈动脉固定后制作石蜡及冰冻切片,行HE染色和油红O染色观察血管壁结构变化、颈动脉斑块形成及脂滴积累情况。(4)离体的套管侧颈总动脉经固定后,做超薄切片并染色,应用透射电镜观察每组小鼠颈总动脉组织巨噬细胞的超微结构。(5)NLRP3炎性小体及自噬相关蛋白表达水平检测:小鼠麻醉后取动脉血,用ELISA检测血清中IL-1β含量;套管侧颈总动脉固定后制作石蜡切片,免疫组化染色后观察斑块内NLRP3和p62表达情况;提取套管侧颈总动脉组织中的总蛋白,用Western blot检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、LC3和P62蛋白的表达。2.细胞实验:采用oxLDL诱导分化的THP-1细胞建立泡沫细胞模型,应用褐藻糖胶、自噬激活剂和抑制剂、GFP-RFP-LC3慢病毒及p62 siRNA干预后,观察自噬流情况,检测NLRP3炎性小体及自噬相关蛋白表达水平。(1)泡沫细胞模型建立:通过给予100ng/ml PMA诱导THP-1细胞48 h,使其分化为巨噬细胞,再用80μg/ml的oxLDL处理36 h,油红O染色确定泡沫细胞模型建立。(2)应用透射电镜和GFP-RFP-LC3慢病毒转染观察细胞自噬情况;(3)NLRP3炎性小体及自噬相关蛋白表达水平检测:ELISA检测上清液IL-1β;用Western blot方法检测不同浓度褐藻糖胶(0,50,100,200,300μg/ml)、自噬激活剂雷帕霉素及自噬抑制剂3-MA,p62小干扰RNA作用后,NLRP3炎性小体及自噬蛋白表达影响;免疫荧光法观察p62及NLRP3共定位;研究结果:1.动物实验:褐藻糖胶够显著性降低ApoE-/-小鼠血清总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白水平;HE及油红O显示褐藻糖胶减少颈动脉中斑块相对面积,降低脂质积累;ELISA结果显示褐藻糖胶能够显著降低血清IL-1β表达;免疫组化显示褐藻糖胶组斑块中NLRP3及p62蛋白水平明显降低;Western blot显示褐藻糖胶降低NLRP3、ASC、caspase-1,IL-1β及p62表达,增高LC3II/I水平;电镜结果显示褐藻糖胶能够显著增高斑块自噬小体数量;2.细胞实验:MTT检测提示褐藻糖胶对细胞活力没有明显影响;油红O染色显示褐藻糖胶能够减少巨噬细胞对脂质的吞噬作用;ELISA结果显示褐藻糖胶能够显著降低细胞上清液中IL-1β表达;Western blot显示褐藻糖胶能够剂量依赖性地降低NLRP3、ASC、caspase-1,IL-1β及p62表达,增高LC3II/I水平;电镜结果显示褐藻糖胶能够显著增高细胞中自噬小体数量;GFP-RFP-LC3慢病毒转染结果显示褐藻糖胶能够增强自噬流;加入雷帕霉素能够增强褐藻糖胶抗炎作用,加入3-MA能够降低褐藻糖胶抗炎作用;荧光显微镜观察到NLRP3和p62共定位,敲除p62后褐藻糖胶抗炎作用消失。结论:1.褐藻糖胶能够降低ApoE-/-小鼠血脂水平,缓解AS易损斑块进展。2.褐藻糖胶能够抑制NLRP3炎性小体表达而发挥抗炎作用。3.褐藻糖胶能够增强巨噬细胞自噬能力,提高自噬流水平。4.褐藻糖胶可能通过p62选择性自噬途径降解NLRP3炎性小体,从而发挥抗AS作用。