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目的:研究罗格列酮对角质形成细胞体外增殖、分化及凋亡的影响,并探讨其可能机制,为罗格列酮临床治疗银屑病提供实验和理论依据。
方法:以永生化人角质形成细胞株HaCaT细胞为银屑病角质形成细胞模型。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度罗格列酮作用于HaCaT细胞24h、48h、72h、96h后对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用;半定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)测定不同浓度罗格列酮对HaCaT细胞分化标志物外皮蛋白,转谷胺酰胺酶1mRNA表达水平的影响;Hoechst33258荧光染色法观察罗格列酮诱导HaCaT细胞凋亡的形态学变化;免疫细胞化学方法检测HaCaT细胞中PPARγ蛋白表达;Western blot方法测定罗格列酮处理HaCaT细胞后β-catenin和Cyclin D1的表达水平。
结果:1.MTT法检测结果表明10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的罗格列酮作用48h后,对HaCaT细胞体外增殖的抑制率分别为18.9%、23.7%、35.1%、44.6%,与溶媒组相比差异有显著意义(P<0.05)。实验结果显示罗格列酮对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用与罗格列酮浓度呈明显的剂量依赖关系。2.RT-PCR检测结果表明10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的罗格列酮作用48h后,HaCaT细胞外皮蛋白与β-actin的荧光强度比值分别为:0.530±0.049、0.638士0.052、0.975士0.028、1.540士0.060,转谷胺酰胺酶1与β-actin的比值分别为:0.598士0.011、0.817±0.006、1.278±0.083、1.777±0.027,与溶媒组相比差异有显著意义(P<0.05),表明罗格列酮可上调HaCaT细胞分化标志物外皮蛋白,转谷胺酰胺酶1mRNA的表达,且外皮蛋白,转谷胺酰胺酶1mRNA的表达随罗格列酮浓度的增高而增强。3.Hoechst33258荧光染色显示罗格列酮处理HaCaT细胞48h后,可见细胞核染色质凝聚、边集、核裂解的形态学改变,而对照组无明显变化。4,免疫细胞化学结果显示HaCaT细胞PPARγ蛋白呈阳性表达,并分布在细胞核及核周。5.Western blot检测结果显示10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的罗格列酮处理HaCaT细胞48h后,β-catenin/β-actin灰度值比值分别为0.744±0.046、0.575±0.012、0.373±0.011、0.228±0.015,CyclinD1/β-actin灰度值比值分别为0.746±0.081、0.601±0.063、0.462±0.033、0.301±0.061,与对照组相比差异有显著意义(P<0.01),结果表明罗格列酮能显著下调β-catenin和Cyclin D1的表达。
结论:1.罗格列酮能够显著抑制人角质形成细胞株HaCaT细胞体外增殖、促进分化、诱导凋亡。2.罗格列酮作用HaCaT细胞后,可能通过下调β-catenin、Cyclin D1的表达发挥其抑制增殖、促进分化、诱导凋亡的作用。