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目的:肿瘤是导致人类死亡的重要原因。尽管手术和放化疗等在肿瘤的治疗中效果显著,但患者普遍存在脱发、恶心、骨髓抑制等严重毒副作用,而且肿瘤患者普遍五年生存率低。外泌体（exosomes）疗法作为一种新兴的非细胞疗法,在肿瘤实验治疗中效果显著。NK细胞是一种天然抗肿瘤细胞,但在临床应用中发现NK细胞存在总体活化效果低、缺乏肿瘤特异性、免疫检查点表达上调以及肿瘤突变负担低等问题,限制了NK细胞在肿瘤治疗中的应用。本研究以exosomes为出发点,旨在探究记忆样NK细胞来源exosomes在肿瘤治疗中的作用及机制;构建工程化的双特异性exosomes激活NK细胞,以期提高NK细胞在抗肿瘤免疫中的疗效。方法:1.通过Ficoll法分离人外周血单个核细胞,IL-12、IL-15和IL-18共同激活和培养记忆样NK细胞（m NK）。收集该NK细胞培养上清并提取exosomes（m NKexo）,通过Nanosight纳米颗粒分析仪对exosomes的大小及浓度进行检测分析;采用Western blot观察exosomes标记CD9、CD63、Alix和cytochrome C的表达;共聚焦显微镜观察exosomes的形态。2.通过CCK-8法检测不同浓度、不同时间点,m NK-exo对肿瘤细胞MGC803、A549、K562活性的影响。流式细胞仪Annexin V/7-aad双染法分析m NK-exo对肿瘤细胞凋亡的影响。分离和培养人骨髓来源间充质干细胞（BMMSCs）,观察m NK-exo对正常细胞活性的影响。3.使用Dio染料对m NK-exo染色后与肿瘤细胞共孵育,共聚焦显微镜观察肿瘤细胞对m NK-exo的摄取。流式细胞术在不同时间点检测Dio阳性肿瘤细胞百分比,观察肿瘤细胞对m NK-exo的摄取速率。采用巨胞饮抑制剂EIPA预处理肿瘤细胞,观察巨胞饮对肿瘤细胞摄取m NK-exo及其凋亡的影响。4.采用Western blot检测m NK-exo处理后肿瘤细胞的凋亡相关信号通路蛋白质的表达变化。广谱caspase通路抑制剂预处理肿瘤细胞,观察肿瘤细胞的凋亡情况。5.分离和鉴定单细胞因子IL-2激活培养的NK细胞来源exosomes,比较该exosomes与m NK-exo对肿瘤细胞的毒性差异。采用室温孵育和反复冻融的方法,将颗粒溶素封闭抗体导入exosomes,观察封闭颗粒溶素后的exosomes对肿瘤细胞凋亡及凋亡相关信号通路蛋白质表达的影响。6.构建同时针对肿瘤细胞HER2和NK细胞CD16抗原的双特异性抗体表达片段,将其连接到慢病毒表达载体,并包装慢病毒。采用慢病毒感染293T细胞,嘌呤霉素筛选能够稳定表达双特异性抗体的293T细胞。分离和鉴定该293T细胞来源的exosomes。流式细胞术检测该exosomes膜外表面HA标签的表达。利用构建的工程化的双特异性exosomes与NK细胞联合治疗肿瘤,观察肿瘤细胞的凋亡情况。结果:1.记忆样NK细胞来源的exosomes,Nanosight分析其直径为122nm左右;Western blot检测发现m NK-exo表达CD9、CD63、Alix,但不表达cytochrome C;透射电镜观察其形态为圆形或椭圆形。2.细胞生长曲线和凋亡结果显示,m NK-exo抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡,并且该抑制作用随着作用时间的延长和外泌体剂量的增加而增强。m NKexo对BMMSCs细胞在12h具有短暂的生长抑制,但并不引起BMMSCs凋亡。3.共聚焦显微镜结果显示,m NK-exo能够被肿瘤细胞摄取。流式细胞术结果显示,肿瘤细胞在3h内就能够摄取m NK-exo,12h左右摄取量达到最大。巨胞饮抑制剂EIPA预处理肿瘤细胞后,肿瘤细胞对m NK-exo的摄取能力减弱,并且由此导致的细胞凋亡也减少。4.Western blot结果显示,m NK-exo上调肿瘤细胞cleaved caspase 3、cleaved caspase 8、cytochrome C的表达。加入广谱caspase抑制剂后,肿瘤细胞的凋亡减少。5.与IL-2活化的NK细胞来源exosomes相比,相同的浓度和相同的处理时间下,m NK-exo对肿瘤细胞活性的抑制更多,引起的细胞凋亡更多。Western blot检测两种NK细胞及其exosomes中细胞毒性分子的表达,发现m NK细胞及其exosomes中的颗粒溶素含量显著高于IL-2活化的NK细胞及其exosomes。颗粒溶素封闭抗体能够减少m NK-exo引起的肿瘤细胞凋亡及肿瘤细胞中凋亡相关蛋白的表达。6.Western blot和流式细胞术检测HA标签结果显示,构建的双特异性exosomes表达HA融合蛋白,且该融合蛋白位于exosomes的膜外表面。与不含双特异性抗体的exosomes相比,双特异性exosomes联合NK细胞处理的肿瘤细胞凋亡增加。结论:细胞因子诱导的记忆样NK细胞来源exosomes,能够通过巨胞饮方式进入肿瘤细胞,并活化caspase信号通路诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞生长;与单细胞因子IL-2刺激的NK细胞来源exosomes相比,m NK-exo具有更强的细胞毒性,且颗粒溶素是导致其细胞毒性增强的部分原因。同时,工程化的αC16/αHER2双特异性exosomes联合NK细胞能够增强NK细胞的肿瘤治疗效果。