肺癌是日益严重的全球公共健康问题,近些年尽管人们努力改善和优化肺癌诊断技术和治疗手段,肺癌仍然占全球癌症相关死亡病例的四分之一,目前每年有220万人被诊断为肺癌,有180万人死于肺癌。肺癌可以分为小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer,NSCLC）,其中NSCLC占所有肺癌病例的85%以上。在过去的20年间,小分子酪氨酸激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的应用使得部分NSCLC患者从中获益并改善了生存率,但是晚期NSCLC患者的总生存期和治愈率仍然很低。此外,影响NSCLC恶性表型关键分子的相关研究仍然有限,亟需寻找新的治疗靶点并探索相关机制以改善NSCLC的诊疗现状。抗增殖蛋白2（Prohibitin 2,PHB2）又称为BAP37、REA或者prohibitone,是一种高度保守和普遍存在的胚胎蛋白,属于抗增殖蛋白（Prohibitin,PHB）家族成员,由核基因PHB2（位于染色体12p13）编码。PHB2是一种多功能蛋白,参与了许多重要的细胞生物学过程,包括信号转导、基因转录、细胞生存、代谢、炎症和凋亡等。PHB2分布于细胞质、线粒体和细胞核中,并与膜受体具有一定的联系。越来越多的证据显示,与正常组织相比,PHB2高表达于前列腺癌、肝癌、食管鳞状上皮癌和弥漫大B淋巴瘤。PHB2的表达与患者的临床病理学特征相关,被认为是与肿瘤预后相关的独立标志物。体外及在体实验表明,抑制PHB2表达可以抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。但是PHB2在NSCLC中的生物学作用并不十分清楚。激活的蛋白激酶C受体1（Receptor for activated C kinase 1,RACK1）属于色氨酸-天冬氨酸重复（WD-repeat）家族成员,与G蛋白β亚基（Gβ）具有高度的同源性,RACK1具有7个螺旋桨样的叶片结构,这为能与其相互作用的分子提供了结合位点。RACK1作为一种重要的骨架蛋白,是多种信号通路的重要调节因子。大量研究显示,RACK1与肿瘤发生发展密切相关,其表达在多种类型肿瘤中发生改变。RACK1的表达及生物学功能具有肿瘤特异性,在胃癌中,RACK1低表达发挥抑癌作用,而在乳腺癌、肝细胞肝癌、黑色素瘤、肺腺癌、十二指肠腺癌和神经纤维瘤中,RACK1高表达发挥促癌作用。研究表明,RACK1表达增加或者降低可导致RACK1相关蛋白的活性改变并进一步影响肿瘤的发生发展,但RACK1及其相关分子所介导的信号通路在NSCLC中的作用机制并不清楚。在本研究中,我们首次发现,相较于癌旁组织,PHB2在NSCLC组织中的表达增加,且PHB2表达与临床病理学指标具有显著的相关性。敲除PHB2可抑制NSCLC的恶性表型,而过表达PHB2则促进NSCLC的恶性表型。此外,PHB2可以与RACK1结合并引起RACK1下游效应分子的相应变化从而促进NSCLC的恶性生物学行为。本研究阐明了PHB2促进NSCLC恶性生物学行为的新机制,提示其可能是NSCLC治疗的潜在新靶点。方法:（1）免疫组化染色分析48例NSCLC临床样本癌组织和配对癌旁组织PHB2蛋白的表达情况,比较PHB2蛋白在不同临床分期的表达异同,分析PHB2蛋白水平与NSCLC组织分化、淋巴结转移和临床分期的相关性,Western blot和RT-q PCR检测PHB2蛋白在NSCLC细胞系和正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B中的表达。（2）慢病毒感染NSCLC细胞,建立PHB2敲减和过表达的稳转细胞株（A549和H1299细胞）,利用Western blot验证感染效率。CCK-8细胞活性检测实验、平板克隆实验、细胞周期检测实验、TUNEL实验、Annexin V-PI双染实验、划痕实验、Transwell细胞迁移侵袭功能测定实验、裸鼠皮下荷瘤实验探讨PHB2对NSCLC恶性生物学行为的影响。（3）通过Co-IP纯化PHB2,通过质谱蛋白组学实验找到可能与PHB2结合的蛋白分子,其中RACK1是潜在的蛋白分子。Co-IP检测PHB2和RACK1的结合。细胞免疫荧光检测PHB2与RACK1在A549细胞内的共定位情况。Western blot和RT-q PCR检测敲低或者过表达PHB2后RACK1的蛋白和m RNA表达情况。同时用si RNA敲低RACK1,Western blot和RT-q PCR检测敲低RACK1后PHB2的蛋白和m RNA表达情况。用环己酰亚胺（cycloheximide,CHX）处理PHB2过表达的A549稳转细胞系,Western blot检测RACK1蛋白的半衰期。用蛋白酶抑制剂MG132处理PHB2敲低的A549稳转细胞系,Western blot检测RACK1降解水平。（4）Western blot检测过表达PHB2的A549稳转细胞系中Akt和FAK的活化水平。同时,在过表达PHB2的A549稳转细胞系中用si RNA敲低RACK1,Western blot检测Akt和FAK的活化水平的变化,CCK-8细胞活性实验和平板克隆实验检测细胞增殖水平的变化,Transwell实验测定细胞迁移和侵袭能力的变化。最后,组化染色分析48例NSCLC临床样本中癌组织和配对的癌旁组织中RACK1的蛋白表达情况,将NSCLC临床样本中RACK1蛋白表达和PHB2蛋白表达做Pearson相关性分析。结果:（1）48例NSCLC临床样本癌组织PHB2蛋白表达显著高于配对癌旁组织,且临床分期Ⅲ/Ⅳ的癌组织PHB2表达显著高于Ⅰ/Ⅱ期。PHB2表达与肿瘤分化、淋巴结转移和临床分期具有显著的相关性。PHB2在NSCLC细胞系中的蛋白和m RNA的表达水平显著高于正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B。（2）Western blot验证感染效率显示,敲减及过表达稳转细胞系建立成功。CCK-8实验显示,在NSCLC细胞系中,与对照组相比,敲减PHB2降低细胞活性,过表达PHB2增加细胞活性。平板克隆结果显示,在NSCLC细胞系中,与对照组相比,敲减组克隆形成的数量显著减少,而过表达组克隆形成的数量显著增加。细胞周期测定结果显示,在NSCLC细胞系中,与对照组相比,PHB2敲减组G1期细胞比例显著增加,S期和G2期细胞比例显著减少,表明PHB2敲减可引起细胞周期阻滞在G1期。流式Annexin V-PI双染实验测细胞凋亡结果显示,在NSCLC细胞系中,与对照组相比,敲低PHB2组的细胞凋亡数量显著增加。TUNEL结果显示,在NSCLC细胞系中,与对照组相比,敲低PHB2组的TUNEL阳性的细胞凋亡数量显著增加,与流式结果一致。划痕实验结果显示,在NSCLC细胞系中,与对照组相比,PHB2敲减组的划痕愈合率显著降低,而PHB2过表达组划痕愈合率显著增加。Transwell结果显示,在NSCLC细胞系中,与对照组相比,PHB2敲减组迁移细胞数和侵袭细胞数均显著减少,PHB2过表达组迁移细胞数和侵袭细胞数均显著增加。同时,小鼠皮下荷瘤模型结果显示,PHB2敲减组的肿瘤大小和重量均显著低于对照组,表明敲减PHB2可抑制NSCLC裸鼠成瘤能力。（3）Co-IP纯化PHB2后进行质谱分析,鉴定出117个可能与PHB2结合的蛋白分子,而RACK1是潜在的可能与PHB2结合的蛋白分子。Co-IP结果显示,PHB2可以和RACK1结合。细胞免疫荧光结果显示,PHB2和RACK1在A549细胞内存在共定位。敲低PHB2后RACK1蛋白表达显著降低,而过表达PHB2后RACK1显著增加,但是无论是敲低还是过表达PHB2,RACK1 m RNA水平并无显著的变化。利用si RNA敲低RACK1后,PHB2无论是蛋白水平还是m RNA水平均无显著的变化,提示PHB2对RACK1的调控可能在翻译后水平。用环己酰亚胺（cycloheximide,CHX）处理PHB2过表达A549细胞,Western blot结果显示,PHB2过表达显著增加了RACK1的半衰期,而蛋白酶抑制剂MG132可逆转PHB2敲低引起的RACK1表达的降低。（4）RACK1可以和其下游分子integrinβ1相互作用,从而进一步激活Akt和FAK信号通路,敲低RACK1可逆转PHB2所引发的FAK和Akt信号通路的激活。敲低RACK1可逆转PHB2促进A549细胞增殖、迁移和侵袭的作用。此外,NSCLC患者癌组织中RACK1表达显著高于癌旁组织,且与PHB2表达呈显著正相关。结论:PHB2可能作为一种重要的致瘤因子参与了NSCLC的增殖、细胞周期夺获、凋亡、迁移和侵袭等恶性生物学行为;PHB2与RACK1结合并调控RACK1稳定性,进一步激活FAK和Akt信号通路,促进NSCLC的恶性表型。尽管PHB2对RACK1的调控还需要进一步研究,我们的工作为PHB2在NSCLC中发挥促瘤作用的相关研究提供了实验依据。