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第一部分氧化型低密度脂蛋白对THP1源巨噬细胞Notch信号表达的影响目的：研究氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)诱导人单核细胞白血病细胞株THP1源巨噬细胞对Notch信号表达及分泌细胞因子的影响,探讨其对动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)发病的可能作用。方法：将THP1经氟波酯(phorbol12-myristate13-acetate, PMA)转化为巨噬细胞后给予终浓度为50mg/L的ox-LDL刺激6h后观察巨噬细胞Notch信号通路4个受体和5个配体差异表达；相差显微镜动态观察细胞形态变化；筛选出表达有显著差异的Notch1、Delta-like4(DIL4)和Jagged1分别给予25mg/L,50mg/L,100mg/L三种不同浓度的ox-LDL刺激48小时,实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime-PCR, RT-PCR)检测不同不同浓度ox-LDL增强THP1源巨噬细胞Notch、D1L4和Jagged1基因表达的影响,采用蛋白免疫印迹(Western-blot)法检测不同浓度ox-LDL对THP1源巨噬细胞Notch1、D1L4和Jagged1蛋白表达的影响；根据筛选出的ox-LDL作用最佳浓度为50mg/L,给予50mg/L的ox-LDL分别刺激THP1源巨噬细胞Oh,3h,6h,12h,24h,48h；RT-PCR检测不同时间点ox-LDL刺激后巨噬细胞Notch、 D1L4和Jagged1的基因表达水平,用Western-blot测定不同浓度及不同时间点Notch、 D1L4和Jagged1蛋白表达,用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法测定上清液中血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesive molecule-1, VCAM-1)和单核细胞趋化分子1(Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)蛋白表达。应用Lipofectamine2000转染3对TLR2siRNA进入THP-1源性巨噬细胞中,RT-PCR筛选出1对沉默效应最明显TLR2siRNA。将筛选出来的TLR2siRNA转染THP-1源性巨噬细胞24h后加入50mg/L ox-LDL共培养48h, RT-PCR分别检测空白对照组和转染TLR2siRNA组Notch、D1L4和Jagged1以及炎性细胞因子VCAM-1与MCP-1的基因表达,Western-blot及ELISA检测Notch1、D1L4, Jagged1、VCAM-1和MCP-1蛋白表达。结果：不同浓度ox-LDL诱导48h后THP1源巨噬细胞发生树突样细胞(dendritic-like cell, DC)形态改变,与对照组相比各组DC样变化比例均显著升高(P<0.05),50mg/L浓度作用最强；RT-PCR检测显示：与未加任何刺激的对照组相比,加入ox-LDL刺激的THP1源巨噬细胞Notch信号受体中Notch1明显升高(P<0.05),Notch2、 Notch3表达轻度下降,Notch4表达轻度升高,但无统计学意义；配体中D1L4和Jagged1表达明显升高(p<0.05),D1L1表达轻度升高,D1L3及Jaggde2表达轻度下降,均未达统计学意义。Western-blot检测Notch信号受体蛋白表达,发现Notch1表达明显升高,Notch4的表达无变化,Notch2和Notch3的表达下降。不同浓度的ox-LDL增强巨噬细胞Notch1、D1L4和Jagged1的表达(p<0.05),此种效应在ox-LDL浓度为50mg/L时上升最明显(p<0.01)；不同时间点ox-LDL刺激后巨噬细胞Notch1、D1L4和Jagged1的表达升高(p<0.05),且此种效应在ox-LDL作用时间为6小时最明显(p<0.01)；与对照组相比ox-LDL增强巨噬细胞VCAM-1与MCP-1的表达(P均<0.05),此种效应在ox-LDL浓度为50mg/L时上升最明显(p<0.01)；筛选出Toll-like receptor2small interfering RNA-1(TLR2siRNA-1)可出现明显的沉默效应,应用Lipofectamine2000转染THP-1源性巨噬细胞,RT-PCR、Western-blot及ELISA结果显示,转染siRNA组Notch1、DIL4和Jagged1表达升高趋势被明显抑制(p<0.05),炎性细胞因子VCAM-1与MCP-1的表达升高也明显被抑制(p<0.05)。结论：ox-LDL能够诱导THP1源巨噬细胞Notchl、 DIL4和Jaggedl表达增加,同时能增加炎性细胞因子VCAM-1和MCP-1的分泌,Notch信号表达上调与TLR2途径有协同作用,ox-LDL诱导巨噬细胞致动脉粥样硬化作用可能部分由Notch信号介导。第二部分急性冠脉综合征诱导单核源巨噬细胞Notch信号及炎性因子的表达目的：探讨急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)患者外周血单核源巨噬细胞中Note信号及炎性细胞因子的表达。方法：密度梯度离心法分离14例稳定型心绞痛患者、15例不稳定型心绞痛患者、21例急性心肌梗塞患者及10名健康对照者外周血单核细胞,经PMA转化为巨噬细胞后,RT-PCR检测外周血单核源巨噬细胞Notch受体基因的差异性表达及炎性细胞因子VCAM-、 MCP-1的基因水平；采用Western-blot法测定Notch受体蛋白的表达,采用ELISA法检测上清液VCAM-1和MCP-1蛋白浓度。根据第一部分实验结果选取TLR2siRNA-1作为实验用转染引物。将冠心病患者外周血单核源巨噬细胞给予TLR2siRNA转染24h后以RT-PCR分别检测健康对照组、冠心病组转染前及冠心病组转染TLR2siRNA后Notch1及炎性细胞因子VCAM-1、 MCP-1基因的表达。结果：RT-PCR检测结果提示与健康对照组相比,稳定型心绞痛组(SA)、不稳定型心绞痛组(UA)和急性心梗组(AMI)三组的Notch1基因表达水平均升高,其中UA组和AMI组明显升高(P<0.05),而SA组无统计学意义(P>0.05)；Notch2、 Notch3表达轻度下降,Notch4表达轻度升高,但均无统计学意义(P>0.05)；SA组、UA组和AMI组VCAM-1与MCP-1的基因表达水平均明显上升(P均<0.05)。与RT-PCR结果一致,Western-blot检测表明：与健康对照组相比,SA、 UA和AMI三组Notch1蛋白表达均上升,其中UA和AMI较对照组明显升高(p<0.05),SA、UA和AMI三组的Notch2和Notch3的蛋白表达轻度下降,Notch4蛋白表达轻度增高,但均未达统计学标准(p>0.05)。ELISA结果表明：与对照组相比,SA组、UA组和AMI组三组的VCAM-1与MCP-1蛋白表达均明显上升(P均<0.05)。与健康对照组相比,TLR2siRNA转染预处理后抑制了ACS患者外周血单核源巨噬细胞Notchl基因表达的增加,Notchl mRNA显著下调(P<0.05)；TLR2siRNA转染预处理后抑制了冠心病患者诱导单核源巨噬细胞VCAM-1与MCP-1的表达增强的作用,VCAM-1与MCP-1基因表达显著下降(P均<0.05)。结论：冠心病诱导外周血单核源巨噬细胞Notch1表达增加,此作用在ACS患者中最显著,同时能增加炎性细胞因子VCAM-1和MCP-1的分泌,Notch1表达上调与TLR2途径有协同作用,ACS诱导巨噬细胞致动脉粥样硬化作用可能部分由Notch信号介导。Notch信号通路及其介导的巨噬细胞天然免疫应答在动脉粥样硬化易损斑块的发生发展中发挥重要的调节作用。