一个甲状腺激素受体β新亚型的初步研究

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甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors,TRs)属于核受体超家族,由TRα和TRβ基因编码。他们分别编码两种主要亚型,而根据转录起始点以及剪切方式的不同,目前发现共有10种同工体(isoforms)。由TRα基因编码的有:TRα1、TRα2、TRα3、TRΔα1、TRΔα2;由TRβ基因编码的有:TRβ1、TRβ2、TRβ3、TRΔβ3以及本实验室发现的TRβΔ*。我们在大鼠肝脏中发现的这种新的甲状腺激素受体亚型,是目前已知的唯一的加长型TR亚型,加长部分位于外显子3和4之间,很可能在TRβ内含子3-4内存在一个新的外显子。在本研究工作中,我们旨在体外表达该新亚型的甲状腺激素受体,实现该受体蛋白在体外的高效表达,纯化后进行氨基酸组成分析以证明由mRNA推演的氨基酸序列的正确性,同时进行了TRβΔ蛋白与激素T3的结合动力学分析及其与靶DNA结合的电泳迁移改变(EMSA)测定。首先从已经构建的pGEM-TEasy/TRβΔ重组质粒中获得甲状腺激素受体βΔ全长cDNA编码序列,将目的基因cDNA插入融合型原核表达载体pETDuet-1,测序鉴定。然后重组表达质粒pETDuet-1/TRβΔ转化E.coli BL21(DE3),进行融合表达。通过SDS-PAGE电泳查看表达产物大小和表达量,Western-blotting进一步鉴定。表达条件优化后,TRβΔ的表达量达到21.94mg/L。重组蛋白TRβΔ占菌体蛋白的32.00%。通过透析袋电洗脱法快速纯化融合蛋白,获得电泳纯的蛋白质。水解蛋白质后,利用氨基酸自动分析仪进行蛋白质氨基酸组成的定量分析。重组蛋白是含有6×His纯化标签的,可以经过金属螯合亲和层析吸附于Ni-NTA树脂层析柱,冲洗去除非特异吸附的杂蛋白,将目的蛋白洗脱。最后,经放射性配体结合试验(RLBA)证实重组TRβΔ可以与T3特异性结合。
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