论文部分内容阅读
越来越多的研究表明,多种病原体及某些肿瘤细胞可通过靶向树突细胞(DC)表面的C型凝集素分子DC-SIGN,引发特异性的细胞信号通路,进而抑制DC的抗原递呈功能,导致机体免疫耐受。已知DC-SIGN的配体主要包括甘露糖型和岩藻糖型两种类型,而且不同类型配体所引发的信号通路是不同的。目前对于前者所引发的信号通路研究得比较深入,而对于岩藻糖型配体所引发的信号通路并不清楚。在本研究中,我们首先构建了DC-SIGN和LSP1两种蛋白的真核表达载体,其次建立了U937-DC-SIGN-LSP1稳转细胞系,最后对DC-SIGN岩藻糖型配体所引发的信号通路进行了初步研究。在构建真核表达载体的实验中,首先经PCR获得DC-SIGN和LSPl的基因片段,然后通过酶切连接构建了pWPXLd-DC-SIGN和pWPXLd-LSP1两种真核表达载体。PCR验证、酶切验证和测序验证结果表明,两种真核表达载体构建正确。在建立稳转细胞系的实验中,首先通过慢病毒侵染技术将pWPXLd-DC-SIGN质粒侵染到人单核细胞系U937细胞株中,在此基础上,再次侵染pWPXLd-LSP1质粒,获得U937-DC-SIGN-LSP1稳转细胞系。FACS和Western blot分析结果表明,稳转细胞系U937-DC-SIGN-LSP1稳定表达DC-SIGN和LSP1蛋白,可用于后续的信号通路研究。在信号通路的研究中,首先通过Co-IP实验验证了DC-SIGN分子的胞浆尾部与LSP1直接连接。然后,在细胞培养体系中加入了DC-SIGN的岩藻糖型配体Lex,用以引发DC-SIGN介导的细胞信号。我们发现,在Lex加入10mmin后,PKCβI和ERK1/2的磷酸化信号显著增强,表明Lex所引发的信号通路中有PKCβI和ERK1/2三种信号分子的参与20mmin后,PKCβI的磷酸化信号没有改变,ERKl/2的磷酸化信号明显减弱,表明PKCβI介导的信号具有持续性,而ERK1/2介导的信号具有瞬时性。目前已知的肿瘤细胞表面的DC-SIGN配体大多为岩藻糖型,本研究对岩藻糖型配体所引发的DC-SIGN介导的信号通路的研究,将有助于进一步揭示肿瘤细胞免疫耐受形成的分子机制。