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金属硫蛋白(Metallothioneins, MTs)广泛存在于各种生物体中,是一类富含半胱氨酸可被镉、铜、锌、铅或汞等金属诱导表达的低分子量蛋白,同时可作为生物标记物用于环境中重金属污染的监测。根据来源,金属硫蛋白被分为15个家族,其中四膜虫金属硫蛋白属于第7家族。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一类纤毛类原生动物。在嗜热四膜虫中存在五种金属硫蛋白基因,分别为：MTT1, MTT2, MTT3, MTT4和MTT5,根据对镉或铜的不同诱导表达响应模式等特征,四膜虫MTs被进一步划分为7a (CdMTs)和7b (CuMTs)两个亚家族。为了获得可用于快速检测环境中重金属污染的全细胞生物传感器(Whole cell biosensor, WCB),我们将MTT1基因启动子分别与作为报告元件的萤火虫荧光素酶基因(Firefly Luciferase, Flue)和海肾荧光素酶基因(Renilla Luciferase, Rluc)重组,构建嗜热四膜虫细胞全细胞生物传感器；此外,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Cr(Ⅵ)诱导五种四膜虫MTs的转录情况,对四膜虫MTs的转录机制进行了初步研究,获得结果如下：1.Flue和Rluc基因的优化Flue基因全长1653bp,编码551个氨基酸,预测分子量为61kDa；而Rluc基因全长936bp,编码311个氨基酸,预测分子量为36kDa。通过PCR技术将Flue基因的终止密码子TAA(在四膜虫中编码G1n)优化为四膜虫中的终止密码子TGA；通过人工合成技术将Rluc基因全序列优化为四膜虫的偏爱密码子。从而获得两种可在四膜虫体内稳定表达的荧光素酶基因。2.含有荧光素酶的四膜虫全细胞生物传感器的构建构建重组质粒pBX-Fluc和pBX-Rluc,其中含有荧光素酶基因,MTTl基因启动子,HA标签,neo2抗性基因；通过基因枪粒子轰击法将pBX-Fluc和pBX-Rluc质粒分别转化入嗜热四膜虫细胞中,通过同源重组和巴龙霉素抗性筛选,Flue和Rluc基因整合到四膜虫大核基因组MTT1位点,获得含有荧光素酶基因的重组四膜虫细胞株B2086-Fluc和CU428-RluC。3.重组四膜虫对重金属离子的监测在重金属离子诱导时B2086-Fluc和CU428-Rluc表达产生荧光素酶,催化荧光素氧化反应产生生物荧光,通过荧光测定仪测定氧化过程中释放的生物荧光,进而通过直观的数据来反应四膜虫WCBs响应重金属离子的情况。结果发现B2086-Fluc对重金属镉和汞的响应最敏感,可检测的最低浓度为5～10ng/mL;对铜和锌的响应较弱,可检测的最低浓度为0.5～1mg/mL;CU428-Rluc也对重金属镉和汞的响应最敏感,可检测的最低浓度为5ng/mL;对铜和锌的响应较弱,可检测的最低浓度为0.1mg/mL; Western blot检测发现全序列优化后的Rluc在重金属离子诱导时的表达量比Fluc高,且重组四膜虫CU428-Rluc响应重金属的范围更广。4嗜热四膜虫CdMTs和CuMTs对Cr(Ⅵ)的不同响应Cr(Ⅵ)对嗜热四膜虫细胞繁殖速度影响的半致死量为80μM,而Cr(Ⅲ)的半致死量为3mM。通过qRT-PCR方法检测Cr(Ⅵ)单独诱导和Cr(Ⅵ)与Cd(Ⅱ)/Cu(Ⅱ)双重诱导时CdMTs和CuMTs的表达情况,结果表明Cr(Ⅵ)单独诱导时促进CuMTs的表达,而对CdMTs的表达影响不明显;Cr(Ⅵ)抑制Cd(Ⅱ)/Cu(Ⅱ)诱导的CdMTs的高表达,而对Cd(Ⅱ)/Cu(Ⅱ)诱导的CuMTs呈上调作用或影响不显著。本研究将金属硫蛋白MTT1基因的启动子与两种荧光素酶报告基因连接,获得可用于检测环境中重金属离子镉和汞污染的四膜虫全细胞生物传感器。并对重金属离子诱导四膜虫MTs转录的分子机制做了初步研究,结果表明重金属离子诱导CdMTs转录的分子机制与高等生物中的类似,而重金属诱导CuMTs转录的分子机制是四膜虫特有的,可能是在进化中新衍生而来。