活性多肽的来源主要有从动植物提取和合成二条途径。合成的方法又主要有化学合成和生物合成二种。一般含30个氨基酸残基以上的多肽用化学合成则比较困难。此外如果这一多肽在临床上使用量较大，并且在动植物组织中含量低，则提取的方法也难以奏效。基因工程作为一种强有力的手段，已经使多种难以提取或者合成的蛋白类药物可以大量获得。但是由于活性多肽分子量小，且易降解的特点，因此，用基因工程表达活性多肽目前仍然比较困难，鲜有既能高水平表达并且纯化与后处理都比较简单的实例报道。综合现有多种重组表达方法的优缺点，我们认为用分泌表达体系进行活性多肽的重组表达是一条较理想的途径。 胰高血糖素是一用途广泛，且用量较大的活性多肽。本文以胰高血糖素为目的多肽，进行了活性多肽的分泌表达体系的研究。 一 研究表明phoA表达体系可以高效分泌表达重组胰高血糖素。在5升发酵罐中，重组胰高血糖素的表达量达到80 mg/L, 占上清总蛋白的30%。经TCA沉淀，分子筛与HPLC三步分离，得到纯化的重组胰高血糖素。重组胰高血糖素不仅具有与天然胰高血糖素同样的物化性质，也具有与天然胰高血糖素同样的受体结合能力和激活腺苷酸环化酶的能力。 二 构建了用强PL启动子控制的phoA 信号肽引导的重组分泌表达体系。研究表明，采用强PL启动子可提高分泌表达的水平，并且在phoA 信号肽引导下，重组产物准确被加工后进入培养基。在摇瓶条件下，40℃时重组胰高血糖素的表达量达到3.46mg/L /A600。另外发现在42℃时，重组蛋白前体则基本上不<WP=3>能被加工并滞留在胞内。 三 采用上述表达体系，研究了phoA信号肽的缺失和突变对重组胰高血糖素分泌效率的影响。结果表明，在信号肽缺失的情况下，转化菌的胞内不能稳定地表达重组胰高血糖素，这一结果符合以前认为多肽不稳定并易于被降解的报道。此外当采用含十聚亮氨酸组成的高疏水性核心的突变型信号肽取代原来野生型phoA信号肽时，发现这一改变导致重组胰高血糖素前体无法被检测出。由此推测，phoA信号肽的疏水核心可能对于稳定前体蛋白比较重要，这一结果与其它类似研究的结果有所不同。此外，胰高血糖素N端组氨酸对分泌效率的影响也做了研究。结果表明，胰高血糖素N端组氨酸影响其分泌效率。当该氨基酸残基缺失后, 重组产物的表达量可以提高约40%。 四 此外，采用上述体系表达了胰高血糖素的高效激动剂—超活性胰高血糖素（[Lys17,18,Glu21] Glucagon）。结果表明在优化表达条件下，转化了分泌表达质粒的大肠杆菌BL21能分泌表达超活性胰高血糖素达3.65mg/L/A600，占上清蛋白的19.5%。同时这一结果也表明该分泌表达体系可以适用于表达其它类似的活性多肽。