肠杆菌产植酸酶的研究

来源 :大连理工大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:kaffee0929
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磷是维持生物体生长发育所必需的元素。植酸磷作为植物或饲料中磷的主要储存形式,由于动植物体内缺少水解植酸磷的植酸酶,不能很好地利用饲料及土壤中的植酸磷,造成了磷的浪费;同时,动物的高磷粪便排入环境,也造成土壤和水体污染;如何提高磷的利用率,节约磷资源,缓解磷污染成为急需解决的问题。植酸酶可水解植酸生成易被动植物体直接吸收利用的肌醇衍生物与磷酸,因此,本论文将围绕产植酸酶菌株Enterobacter asburiae ZSH Y1的生长产酶条件优化以提高植酸酶的酶活,对植酸酶进行分离纯化及酶学性质表征,探求其反应的最适条件,以及植酸酶的重组表达获得大批量可溶性表达的重组植酸酶,主要研究结果如下:通过单因素实验,以蒙金娜培养基为基础培养基,研究培养基组成与环境因素对菌株E.asburiae ZSH Y1生长产酶的影响,最终确定培养基中葡萄糖含量4%、(NH4)2SO4含量0.1%、培养p H 7.5、装液量25%、培养温度35℃、培养时间36 h,经过优化植酸酶活力提高至1.16 U/m L。在优化培养条件下,培养E.asburiae ZSH Y1,上清液经硫酸铵分级盐析沉淀与阴离子交换层析(Q FF),分离纯化出电泳纯天然植酸酶Phy ZSHY1-N,分子量为48622.86Da。酶学性质分析表明Phy ZSHY1-N是一种中温酸性植酸酶,最适反应温度为55℃,最适反应p H为5.0,以植酸钠为底物时,Phy ZSHY1-N的Km为1.026 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.568μmol/(min·mg protein),kcat为4.184 s-1,催化效率kcat/Km为4.08L·s-1·mmol-1。克隆菌株E.asburiae ZSH Y1植酸酶基因phy E,分析基因序列,获得phy E全长1359bp,编码452个氨基酸,前20个氨基酸为信号肽。将基因phy E-nsp与质粒p ET28a(+)连接构建表达载体,在E.coli BL21(DE3)中进行重组表达,利用Ni-NTA和Q-Sepharose Fast Flow对重组酶Phy ZSHY1-nsp纯化,重组酶的最适温度和p H分别为60℃和4.5,Cu2+、Co2+等金属离子及SDS抑制酶促反应。植酸钠为底物时,Km为0.859 mmol/L,kcat为16.036 s-1,kcat/Km为18.66 L·s-1·mmol-1。综上,本研究获得了天然植酸酶Phy ZSHY1-N与重组植酸酶Phy ZSHY1-nsp,后者温度稳定性和酸碱稳定性较好,与底物植酸钠的亲和性和转化效率较好,可短时间内获得大批量具有His标签的、易于分离纯化的重组植酸酶,更适合用于后续酶制剂的开发,应用于饲料的高值化生产,提高饲料营养及利用率。
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