单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因的克隆与原核表达

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单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes, LMO)是李斯特氏菌属的重要成员,属于细胞内寄生的革兰氏阳性杆菌。该菌在病原学上作为一种重要的人畜共患和食源性疾病的病原菌在公共卫生学上有重要意义,近几年已在许多国家报道由LMO引起的李斯特氏菌病及食物中毒。本菌可致人和动物患脑膜炎、败血症、脑膜脑炎、流产等,发病率虽低,但死亡率高达30%~70%。Hemolysin(hly)基因是LMO的毒力标志基因,属于巯基活化的结合胆固醇的细胞溶血素家族,是LMO必要的致病因子。本实验根据GeneBank已发表的LMO hly完整基因序列,设计并合成分别带有SalI和XbaI酶切位点的上下游引物TU、TL,以LMO 0586株总DNA为模板,应用PCR技术,扩增得到hly全基因。将纯化的该基因片段克隆到pMD18-T载体中,通过单双酶切及PCR鉴定筛选带有插入片段的阳性重组质粒,命名为pMD18-T─hly。对克隆的hly基因进行序列测定,测序结果显示LMO 0586 hly基因全长1646bp,含有完整的开放阅读框架,编码529个氨基酸。运用DNAMAN软件将测序结果与国外报道的LMO F6789株、LMO F2365株进行同源比较,结果显示,核苷酸序列同源性分别为99.70%和99.39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较,同源性分别为99.82 %和98.90%。以重组质粒pMD18-T─hly为模板,重新设计并合成分别含有BamHI、XhoI酶切位点的上下游引物PU、PL,通过PCR扩增hly基因,然后将其定向克隆到原核表达载体质粒pGEX-6P-1的BamHI与XhoI之间,命名为pGEX-6P—hly。将鉴定的阳性重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中。挑选含重组质粒的菌落,经IPTG(1.0mmol/L)诱导后,经SDS-PAGE分析,目的蛋白与谷胱甘肽巯基转移酶(GST大小约为26ku)融合后的重组蛋白大小约为72ku。光密度扫描对表达产物进行初步定量表明,72ku融合蛋白占菌体总蛋白的20.8%。采用Western-blot对表达产物进行分析,结果表明所得hly融合蛋白具有较好的抗原反应性。本研究在国内首次克隆并获得了LMO 0586株 hly全基因序列,并对LMO溶血素基因的蛋白表达作了初步研究。本研究成果对从LMO中分离溶血素蛋白,并为进一步研究溶血素蛋白的结构、功能,LMO 的分子流行病学调查、诊断试剂的开发提供了依据。同时,对本病的免疫学检测和食品的快速检测提供了物质基础。
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