花鳗鲡GH基因的克隆、序列分析及原核表达

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生长激素(Growth hormone,GH)是由脑垂体嗜酸性细胞分泌的单链多肽类激素,一般由173-191个氨基酸组成。GH具有广泛的生理功能,可以显著促进个体的生长发育,如体重和体长的增加、骨骼和肌肉的生长、脂肪的代谢等。本论文对花鳗鲡(Anguilla marmorata)GH基因首次进行了克隆、测序,对其在10种组织中的表达情况进行了定量分析,利用克隆得到的花鳗鲡GH基因重组得到能稳定表达的质粒并可成功诱导得到花鳗鲡的GH融合蛋白。主要研究结果如下:  1.根据已公布的欧洲鳗鲡GH基因设计引物,以花鳗鲡垂体RNA反转录得到的cDNA为模板,利用PCR技术扩增得到花鳗鲡GH基因的完整开放阅读框ORF,共630bp,其中有4个外显子,长度分别为150bp、117bp、162bp、201bp。以花鳗鲡基因组DNA为模板成功获得花鳗鲡GH基因完整内含子序列,共3个内含子,长度分别为623bp、852bp、474bp。  2.对包含花鳗鲡在内的30种脊椎动物GH的CDs序列进行遗传距离分析发现:花鳗鲡与欧洲鳗鲡及日本鳗鲡的遗传距离最近为0.016;与人的遗传距离最远,为0.646。对30种脊椎动物的进化树分析,发现可以分为两大分支:(1)爬行类、鸟类、哺乳类聚为一类;(2)花鳗鲡与其他鱼类(包括欧洲鳗鲡、日本鳗鲡、长吻雀鳝、弓鳍鱼)及两栖类聚为一类。  3.运用实时荧光定量方法对花鳗鲡垂体、下丘脑、肌肉、脂肪、鳃、皮肤、脾、胃、心脏、肝胰脏共十个组织中GH mRNA的表达量进行分析,发现在垂体中表达量最高,其次为下丘脑中的表达,在肌肉、脂肪、心脏、鳃等组织中有微量表达,在胃、肝脏中的表达量接近零。  4.花鳗鲡GH蛋白质的一级结构是由209个氨基酸组成,分子量约为23.57KD,等电点(pI)值为6.52,酸性氨基酸(Asp-Glu)含量为11.9%,碱性氨基酸(Arg+Lys+His)含量为13.8%,疏水性氨基酸含量为45.8%,亲水性氨基酸含量为41.8%。在整个氨基酸序列中亮氨酸(Leu)含量最高,为12.4%,其次为色氨酸(Ser),为9.0%。不稳定系数为35.87,表明该蛋白质稳定性较高。脂肪酸指数为90.96。  5.成功将花鳗鲡GH基因的CDs序列连接进pET-32a质粒,并将重组质粒转化进大肠杆菌DE3(也称BL21),经SDS-PAGE检测证明重组质粒能稳定表达融合蛋白。在IPTG浓度为0.1mg/L,诱导时间为4h,温度37℃时表达量最高。
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