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疫霉菌在分类学上隶属于卵菌,是一类形态和侵染特征与真菌类似的真核微生物。疫霉菌能够侵染许多重要的农作物和花卉植物,可引起毁灭性的植物病害,每年在世界范围内造成巨大的经济损失。系统发育研究表明,卵菌在进化上与真菌相距较远,因此,目前大部分针对真菌的杀菌剂对卵菌无效。我们以寄生疫霉菌(Phytophthora parasitica)为模式卵菌,解析疫霉菌无性发育和与寄主植物互作的的分子机制,以期为建立卵菌类植物病害防治的新途径、新方法提供科学依据。疫霉菌无性繁殖过程中形成多核的孢子囊。通常,孢子囊细胞质发生割裂形成游动孢子,游动孢子是大部分疫霉菌最重要的初侵染接种体。游动孢子可主动的靶向寄主植物细胞,一旦接触到寄主植物,即迅速休止并开始萌发。萌发的芽管往往形成附着胞类似结构,以利于进一步侵入寄主植物。目前有关游动孢子发育分子机制的研究还十分有限,仅有数个与无性发育相关的基因功能被解析。以寄生疫霉菌作为模式,在解析疫霉菌无性发育的遗传基础的研究中,鉴定到一个结构特殊的质膜氢离子通道蛋白基因PnPMA1,该基因在游动孢子和萌发的休止孢阶段上调表达,其编码蛋白的碳端含有一个约155个氨基酸残基的插入区段,该区段在其他物种的同源蛋白中未见报道,可能是卵菌所特有的。本研究通过亚细胞定位、拓扑结构分析、基因沉默等试验,旨在揭示PnPMA1蛋白在疫霉菌无性发育和致病中的作用。在此基础上,我们还利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)-寄生疫霉菌亲和互作模式体系,以PnPMA1作为疫霉菌内源靶标基因,GFP作为报告基因,测试了在寄主植物中表达同源双链RNA对入侵的寄生疫霉菌靶标基因是否具有沉默效应。主要研究结果如下：1.采用PnPMA1基因自身调控序列,利用融合PCR方法,构建PnPMA1与GFP基因的融合表达载体,转化寄生疫霉菌后,观察转化子菌丝中GFP荧光信号的分布情况,结果表明PnPMA1蛋白定位在细胞质膜上。2.利用三维结构同源建模的方法,以拟南芥质膜氢离子通道蛋白AHA2作为模板,预测PnPMA1的空间结构,表明PnPMA1蛋白碳端的特殊插入区段定位在细胞质膜外侧；另外,利用lacZ融合的生物化学方法,通过在模式系统酵母中分析不同重组载体获得的酵母转化子的β-半乳糖苷酶活性,进一步证明了PnPMA1蛋白碳端特殊插入区段定位在细胞质膜外侧,这为解析PnPMA1的生物学功能提供了重要线索。3.利用反义核酸和发夹结构载体分别转化寄生疫霉菌,均获得了稳定的PnPM1基因沉默转化子。利用Northern技术检测到沉默转化子中有同源siRNA分子的累积,通过定量RT-PCR确认了siRNA分子的累积丰度与靶标基因的表达呈负相关，这表明siRNA分子参与了寄生疫霉菌的基因沉默，使我们对疫霉菌基因沉默机制有了进一步的认识。其中沉默转化子T77中PnPMA1基因的表达下调了92%。4.对获得的PnPMA1基因沉默转化子进行表型分析，发现PnPMA1失活使游动孢子失去游动性，在释放以后迅速形成休止孢，且随后的休止孢萌发也受到明显抑制；此外，PnPMA1失活还导致寄生疫霉菌部分游动孢子畸形。这些研究结果表明PnPMA1在游动孢子发育过程中起重要作用。5.分别以PnPMA1作为内源靶基因，GFP作为报告基因，确认了在疫霉菌与寄主植物互作过程中，通过寄主植物表达疫霉菌靶标基因的dsRNA分子不足以诱发疫霉菌靶标基因的沉默，这表明病原卵菌可能缺少摄入环境中的基因沉默信号的遗传元件，或转运进入病原卵菌细胞的dsRNA或siRNA分子不足以激活同源靶标基因的沉默。因此，寄主诱导的基因沉默在卵菌病害防控中的应用潜力十分有限。