小窝是脂筏与小窝蛋白-1(Caveolin-1,Cav1)结合而形成的凹陷结构,Cav1碳端133、143和156位上的三个半胱氨酸,是棕榈酰化位点,可以帮助蛋白锚定在膜上。研究发现,细胞小窝可以响应细胞膜张力变化,但是这种变化的详细机制尚不清楚。Cav1的三个棕榈酰化位点可能是感应细胞膜张力变化的关键结构。为了确定Cav1的棕榈酰化位点在小窝力响应信号转导中的作用,本课题结合体内和体外实验进行了如下研究:1.细胞水平上观察Cav1的分布及棕榈酰化对内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的影响。成功构建Cav1和Cavin1的真核表达载体并转染内皮细胞,通过激光共聚焦显微镜观察,Cav1和Cavin1在细胞内是共定位的。通过低渗刺激下eNOS活性检测发现,离体细胞在力感应下eNOS的活性降低,这为深入探索Cav1介导的机械敏感信号传导的机制打下基础。2.设计含有一个或多个棕榈酰化位点的Cav1相关多肽,在渗透压变化时表征其与磷脂膜相互作用的变化。通过透射电镜观察,以Cav1为功能肽段设计的HS-1、PAL-1,在低浓度时均可以在水中形成300-500nm大小的囊泡结构,高浓度则逐渐融合形成纤维。通过LB膜分析压缩等温线,HS-1、PAL-1与磷脂膜相互作用时产生不同的构象,并且棕榈酰化在以胆固醇依赖的方式插膜中具有重要意义。通过圆二色谱分析,棕榈酰化可以促进多肽本身形成α-螺旋结构。通过低渗刺激的固有荧光变化实验可以看出,较低渗刺激时,棕榈酰化的多肽插膜构象在力感应下具有一定的缓冲作用。