丙型肝炎病毒(HCV)JFH1是目前唯一能在体外培养的细胞中高效复制，并产生感染性子代病毒的病毒株。为了研究其高效复制的机制，分析了病毒因子（HCV RdRp和3UTR）和宿主因子（鞘磷脂，SM）对不同病毒株复制的影响。首先，对1b HCR6，2a JFH1和J6CF等三个病毒株RNA聚合酶的体外活性以及3 UTR的结构进行了比较；然后，分析了鞘磷脂对HCV复制的影响；最后，进一步分析了HCV RdRp在表面活性剂作用下的生化特征。　　 1b和J6CF RNA聚合酶的活性分别是JFH1的6.4％和7%。为了找到JFH1 RNA聚合酶高活性的关键区域，对lb和J6CF RNA聚合酶特异性的氨基酸进行点突变，使之成为JFH1型氨基酸，并分析突变体的聚合酶活性变化。1b聚合酶大拇指结构域的四个氨基酸突变（S377R，A450S，E455N和Y561F）都增强了聚合酶的体外转录活性。同时，还对HCV RNA聚合酶的动力学常数Km，Vmax和模板结合能力进行了比较。1bA450S的Vmax和模板结合能力都比野生型的高，与其活性变化一致。以上结果表明，HCV JFH1 RNA聚合酶较快的聚合反应速率和模板结合能力是JFH1病毒RNA聚合酶获得体外高活性的关键因素。　　 已有的研究表明，丙型肝炎病毒NS3解旋酶和NS5B-3X(N5BX)区域是JFH1病毒在体外培养的Huh7细胞中高效复制所必不可少的。在此基础上，通过比较HCV2a亚型的J6CF和JFH1病毒，进一步研究了HCV基因组复制活性和产生子代病毒的效率二者之间的关系，尤其是N5BX区域在病毒复制中的作用。首先，将具有高活性的1b聚合酶突变体的相应氨基酸位点引入到J6CF中，并且获得了具有高聚合酶活性的J6CF RdRp突变体Q377R，A450S．S455N，R517K和Y561F。在含有JFH1病毒N3H区域和3’非翻译区(UTR)的J6CF病毒基因组上，引入JFH1型的A450S，R517K和Y561F三个氨基酸突变到J6CF RdRp中后，J6CF就能够像JFHl--样在体外培养的细胞中高效复制。Y561F位于5BSL3.2顺式作用元件(CRE)的环上，并且561F能够通过增强CRE与3XSL2之间的相互作用来促进病毒的复制。还分析了HCV基因组3UTR的结构对病毒复制的影响，结果表明，JFH1的polyU/UC区比J6CF的更短，更有利于其高效复制。此外，位于JFH1可变区的9458G形成特殊的更适合病毒复制的RNA二级结构。总之，除了JFH1的N3H区域外，高聚合酶活性，较强的RNA相互作用和最适的3UTR结构使J6CF由非复制型病毒转变成了可以在体外培养的细胞中复制的复制型病毒。　　 HCV的复制和感染依赖于宿主细胞的脂质成分，并且其复制过程能够被鞘磷脂(SM)生物合成途径的抑制剂所抑制。发现鞘磷脂能结合到1bRdRp上，并增强其体外转录活性。鞘磷脂也与1a和JFH1（RdRp结合，但是并不能激活其聚合酶的活性。鞘磷脂不能结合或激活J6CF RdRp。HCV聚合酶231-260位氨基酸所形成的螺旋-转角．螺旋结构(helix-turn-helix)是鞘磷脂的结合区域(SBD)，也是鞘磷脂结合和激活聚合酶所必需的区域。两个螺旋结构231-241和247-260是激活聚合酶活性的重要区域，而其中的238S和248E是维持螺旋结构以及鞘磷脂激活聚合酶的重要氨基酸位点。位于第一个螺旋上的氨基酸241Q和转角颈部的氨基酸244D是鞘磷脂结合聚合酶的重要位点。这两个氨基酸部位于聚合酶分子的表面。鞘磷脂的磷酸胆碱的带电性对．激活HCV聚合酶的活性很重要。然而，磷酸胆碱自身却不能激活聚合酶。二十个鞘磷脂激活一个聚合酶分子。鞘磷脂对HCV聚合酶活性的影响也在复制子系统中利用病毒学方法得到了证实。还发现，HCV NS5B的鞘磷脂结合区域(SBD)．是其在脂筏膜上定位的区域，因为含有NS5B A242C/S244D突变位点的突变体复制子的定位转移到了脂筏上，而野生型的JFH1聚合酶并不定位在脂筏上。这个实验结果与HCV突变体复制子对鞘磷脂抑制剂多球壳菌素(myriocin)的敏感性实验结果一致。由于鞘磷脂的主要结合位点是HCVRdRp的241Q，而大多数HCV病毒聚合酶中该位点是保守的，因此，鞘磷脂对聚合酶的结合和激活作用可以用作研制抗病毒药物的靶点。　　 表面活性剂被用于溶解脂类和蛋白。分析了各种表面活性剂对HCV聚合酶活性的影响。发现，非离子型表面活性剂（Tween80和Brij35）和两性表面活性剂(CHAPS)能够激活lb RdRp的活性高达8到16.6倍。离子型的表面活性剂在0.01%的低浓度条件下，就使得HCV RdRp的活性完全散失。这些表面活性剂的最大激活作用出现在其临界微团浓度(CMC)处。表面活性剂对HCV RdRp的激活机制是使1b RdRp从多聚体转变成单体来结合更多的RNA模板，并增强了聚合酶的聚合反应速度。JFH1聚合酶在没有Triton-X-100存在时就有很高的转录活性。通过比较JFH1和Triton X-100激活了的lb RdRp的活性和模板结合力，发现HCV RdRp单体是有活性的形式。JFH1的502位氨基酸是丝氨酸，在生理条件下以单体形式存在。然而，HCV RdRp在0.02% Triton X-100的作用下，对底物的亲和力降低了，并且完全失去了其原有的保真性。因此，当用含有表面活性剂的化合物来筛选抗HCV RdRp的药物时，应该注意这些表面活性剂的影响。