近年来随着经济的发展,物质生活水平的提高及饮食结构的改变,以心肌梗死为代表的心血管系统疾病在我国的发病率呈上升趋势。由于心肌细胞是终末分化细胞,心肌梗死后,存活的心肌细胞数目大量减少,心肌组织由纤维结缔组织代替,瘢痕逐渐形成,导致心功能下降。目前针对心肌梗死等心血管疾病的治疗方法有药物治疗、介入治疗、外科血运重建、激光治疗等。但这些治疗措施均不能从根本上挽救濒死的心肌组织。因此,近年来,通过细胞移植治疗心血管疾病已成为研究的热点之一。而选择恰当的用于移植的“种子”细胞则是决定移植治疗心血管疾病成功与否的关键。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是存在于骨髓中除造血干细胞之外的另外一种干细胞,其具有分布广泛、取材方便、易分离扩增、低免疫源性、易被外源基因转染等优点,已成为治疗心血管系统疾病极有前景的种子细胞。大量研究证明,BMSCs在一定的诱导条件下可定向分化为心肌细胞。二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)是目前常用的诱导分化剂之一,其作用机制主要是通过抑制C-MYC基因表达,从而降低细胞内源性聚腺苷二磷酸核苷水平。本实验通过体外分离培养SD大鼠的BMSCs,并用二甲基亚砜诱导使其定向分化为心肌细胞,对分化过程进行细胞形态学、心肌特异基因及转录因子表达加以分析研究,以探讨DMSO诱导BMSCs定向分化为心肌细胞的可行性及最佳诱导浓度,为BMSCs临床修复受损心肌组织的应用提供理论依据。1BMSCs的诱导分化：利用全骨髓贴壁分离培养法自3周龄SD大鼠四肢长骨骨髓中分离纯化BMSCs,由含10%胎牛血清、双抗(青霉素100mg/L,链霉素100g/L)组成的IMDM完全培养基在37℃、5%C02条件下进行培养。接种后12h半量换液,24h完全更换培养基,此后每隔2d换液。选生长良好的第2代BMSCs分别加入含DMSO(0.6%、0.8%、1.0%)的IMDM培养基分组诱导,依次为A、B、C组,不加诱导剂为空白对照组(D组),3d后去除诱导培养基,之后各组均加入不含DMSO的IMDM培养基继续培养4周。2免疫细胞化学染色：取各组诱导后第28d的细胞,行免疫细胞化学染色技术并观察分化细胞中结蛋白(desmin)、α-横纹肌肌动蛋白(a-actin)、P38MAPK、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达情况。3免疫荧光双标染色技术：取浓度1.0%DMSO的诱导组培养第28d的细胞爬片,采用desmin、cTnT进行荧光双重标记,观察二标记物在分化细胞的共表达情况。4透射电镜技术：取浓度1.0%DMSO的诱导组培养28d生长旺盛、形态均一的细胞制备电镜样本,2.5%戊二醛固定,刮下全部细胞,离心制成细胞团块,常规脱水包埋,超薄切片后,透射电镜观察分化细胞的超微结构。5相差显微镜形态学观察：原代细胞培养24h已有部分贴壁,换液后去除未贴壁的细胞。在72h可见部分细胞伸出突起,呈扁平三角形或多边形,核大而饱满。1w左右细胞呈短梭形,体积进一步增大。细胞传代后形态排列较为均匀。第2代BMSCs经不同浓度DMSO诱导后,细胞的形态在不同的时间段存在差异。A组和B组诱导7d的BMSCs形态变化不明显,与对照组类似,随后则逐渐转变成长柱形。C组BMSCs于诱导后的7d时形态已转变成类长柱形,28d时细胞体积则变小,排列一致。6免疫细胞化学检测：诱导各组的BMSCs中均可见desmin、a-actin、 cTnT、cTnI和P38MAPK的阳性细胞,而对照组以上各标记物则均呈弱阳性或阴性表达。诱导各组与对照组以上标记物的阳性率均具有显著性差异(P均<0.01)。在各诱导组中,各标记物的阳性率在C组均最高,显著高于A、B组(P均<0.05)。7免疫荧光双标染色：分化细胞胞浆内desmin、cTnT呈共表达。细胞质内desmin的表达呈红色,cTnT的表达呈绿色,当两者同时被观察时可见其重叠的部位变成黄色。8透射电镜观察：分化细胞的超微结构清晰完整,胞核位于细胞中央,呈卵圆形,细胞器丰富而发达,含有大量的粗面内质网和线粒体,也有糖原和核糖体。胞质内富含平行排列的肌丝。形态学及免疫细胞化学检测结果证实DMSO可以在体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞并表达心肌特异性蛋白desmin、α-actin、cTnT、cTnI和P38MAPK,且1.0%DMSO可能是一种合适的诱导浓度。免疫荧光双标染色及电镜结果均进一步证实DMSO可以诱导BMSCs获得心肌分化表型。