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目的：建立脑卒中后抑郁(Post-stroke depression,PSD)动物模型并评价西酞普兰干预效应；观察PSD模型大鼠海马神经干细胞(neural stem cell,NSC)原位增殖、存活和分化及西酞普兰离体与在体干预作用；观察PSD大鼠海马齿状回5-羟色胺1A受体(5-HTR1A or serotonin 1A receptor)的表达及西酞普兰干预效应。
方法：根据不同研究目的,将雄性SD大鼠分为正常组、卒中组、应激抑郁组、(拟)PSD组和西酞普兰干预组。
1、大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)法建立永久性局灶脑缺血模型,复合慢性不可预见温和应激(Chronic mild stress,CMS)结合孤养法,建立拟PSD大鼠模型并予西酞普兰(10mg/kg,i.p.)干预6周同时动态评估其行为学变化。
2、运用不同方法标记5-溴脱氧尿苷嘧啶(5-Bromodeoxyuridine,5-BrdU or BrdU),通过免疫组织化学、免疫荧光双标染色及共聚焦成像方法,动态检测并比较各研究组大鼠左侧海马齿状回BrdU及其与神经元表面标记神经元特异性核蛋白(Neuronal nuclear antigen,NeuN)或星形胶质细胞表面标记胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)共表达。建立胚胎大鼠海马神经干细胞模型,予以不同浓度西酞普兰(终浓度为0.5μmol/L、1.0μmol/L)干预,甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法、免疫荧光双标染色及共聚焦成像检测西酞普兰对胚胎大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响。
3、荧光实时定量聚合酶链式反应(Real-time Polymerase Chain Reaction,Real-time PCR)和Western blotting印迹法检测并比较各研究组大鼠CMS开始后第19和第28天(以下分别称第19和第28天)海马齿状回5-HT1A受体mRNA和蛋白表达水平。
结果：
1、第19天,PSD组模型大鼠水平活动得分(与基线、正常组和卒中组相比,均P<0.001;与应激抑郁组相比,P<0.01)、垂直活动得分(与基线、正常、卒中组相比均P<0.001;与应激抑郁组相比均P<0.05)显著降低。第19至第42天,PSD组模型大鼠水平活动得分(从37.8±1.7至34.2±1.2)和垂直活动得分(从9.7±0.8至7.8±0.8)显示与应激抑郁组水平活动得分(从41.0±1.3至42.3±0.8)、垂直活动得分(从11.2±0.4至11.7±0.8)不同,呈进行性下降趋势。第3～6周蔗糖水饮用比例较基线及各组显著减少(均P<0.001)。
2、与卒中组相比,PSD组大鼠左侧(伤侧)海马齿状回BrdU+细胞数在脑梗死后第7天(195.3±10.7 vs.204.5±12.7)无明显变化,第21天(28.5±4.6 vs. 72.2±5.9)明显减少,而高于正常组,差异均有统计学意义(均P<0.001),西酞普兰组BrdU+细胞数较PSD组明显增加(48.3±7.4 vs. 28.5±4.6),差异有统计学意义(P<0.001);与卒中组相比,PSD组大鼠增殖细胞的存活数量在脑梗死后第21天(156.2±6.0 vs。232.2±21.0)、30天(70.2±5.0 vs. 123.7±6.4)和45天(81.2±2.8 vs. 136.2±6.2)明显减少,差异均有统计学意义(均P<0.001)。PSD大鼠左侧(伤侧)海马齿状回BrdU+/NeuN+细胞比例在脑梗死后30天[(69.0±3.4)％)]和45天[(78.3±2.4)％]均明显减少(P<0.001;P<0.01)。BrdU+/GFAP+细胞比例在脑梗死后30天和45天均明显增加(P<0.01;P<0.001)。西酞普兰组增殖细胞的存活数量较PSD组在在脑梗死后第21天(196.3±11.1 vs. 156.2±6.0)、30天(93.7±4.8 vs。70.2±5.0)和45天(143.5±8.5 vs. 81.2±2.8)明显增加,差异均有统计学意义(均P<0.001);西酞普兰组BrdU+/NeuN+细胞比例在脑梗死后30天[(76.7±4.60)％vs。(69.0±3.4)％),P<0.05]和45天[(88.0±4.60)％vs. (78.3±2.4)％,P<0.011较PSD组均明显增加。MTT结果显示西酞普兰(1.0μmol/L)干预后第3天至第7天,吸光度(A570nm)显著增高(均P<0.0001);西酞普兰(0.5 μmol/L、1.0μmol/L)。干预7d后,NeuN阳性细胞率分别达(59.5％±2.8)％、(57.8％±2.1)％,均高于对照组的(47.3％±4.3)％(均P<0.05)。
3、第19天,PSD组5-HT1A受体mRNA表达低于正常对照、卒中组(0.012±0.001 vs 0.360±0.010、0.039±0.002,P<0.001、P<0.01);其蛋白表达低于正常对照、卒中组(0.400±0.030 vs 1.320±0.060、0.610±0.060,均P<0.001)。第28天,PSD组5-HT1A受体mRNA低于正常对照、卒中组(0.013±0.001 vs 0.336±0.011、0.063±0.006,均P<0.001);其蛋白表达低于正常对照、卒中和应激抑郁对照组(0.080 ±0.020 vs 0.620±0.030、0.260±0.040、0.320±0.020,均P<0.001)。CMS开始后第19天和28天,西酞普兰组5-HT1A受体mRNA和蛋白表达均高于PSD组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。
结论：
1、拟PSD模型大鼠充分并持续表现快感缺乏等症状,较准确模拟PSD患者的核心临床症状,可操作性和重复性较好,是研究PSD较为理想的实验动物模型。
2、PSD大鼠卒中后海马齿状回原位增殖的神经干细胞数量减少、存活降低,分化为神经元比例下降,胶质细胞比例增加,提示卒中后损伤修复代偿机制缺陷,可能导致PSD发生。
3、PSD大鼠海马齿状回5-HTR1A表达水平降低,提示此改变可能参与海马神经再生障碍的发生,成为PSD发病的分子机制之一,西酞普兰逆转5-HTR1A表达水平低下,改善海马神经再生障碍发生及PSD核心症状,可能成为5-羟色胺再摄取抑制剂(Selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI)类药物治疗PSD的靶标。