目的动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种慢性进行性炎症疾病,疾病的发生涉及多种发病机制;其中,血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的激活、迁移与增殖是AS发生的重要病理过程,有研究指出VSMCs增殖与凋亡的失衡是AS发生过程中斑块形成的重要环节,而高脂血症是AS发生发展的危险因素。前期研究已证实中药水蛭对早期AS大鼠VSMCs的增殖及表型转化具有一定的抑制作用,同时能够调降血脂,但尚不清楚具体作用机制。p38MAPK信号转导通路是一条可调控细胞增殖与死亡的重要通路,可参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程;ACAT-2、Fas、HMGCR为肝脏中参与调节脂质代谢及合成过程相关的酶。本研究通过观察中药水蛭对早期AS大鼠的影响,旨在探索p38MAPK信号转导通路在AS发生发展过程中对大鼠VSMCs增殖与凋亡的调控作用,观察中药水蛭干预过程中大鼠血脂的动态变化,探讨中药水蛭抗动脉粥样硬化以及调降AS大鼠血脂的机制。方法1.建立动物模型:采用高脂饲料（High fat diet,HFD）喂养联合腹腔注射维生素D₃的方式建立早期AS大鼠模型。40只健康雄性Wistar大鼠适应性喂养1周后,采用数字随机表法将大鼠分为4组:正常对照组,模型组,水蛭低(0.6g·kg^-1)、高(1.2 g·kg^-1)剂量组,每组各10只。分组完成后称量大鼠体重,随即对模型组,水蛭低、高剂量组大鼠给予一次性腹腔注射维生素D₃注射液60万IU·kg^-1,同时给予HFD喂养;对正常对照组大鼠给予腹腔注射等量生理盐水,同时给予普通饲料喂养。2.中药水蛭干预:腹腔注射完成后第2天,将配好的中药水蛭药液按照剂量分别对两水蛭干预组进行灌胃干预(10mL·kg^-1),同时对正常对照组和模型组给予等量蒸馏水灌胃,每天1次,连续灌胃8周。每周末称大鼠体重1次以调整灌胃量。3.标本收集及检测:于实验初及第4周末对各组大鼠尾静脉取血检测血脂水平;第8周实验结束时,处死大鼠留取所需组织,同时依据体重计算大鼠肝脏指数;生化分析仪检测大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C的水平;使用ELISA法测定大鼠TGF-β1的水平;免疫组织化学法（Immunological Histological Chemitry,IHC）检测VSMCs中PCNA、Caspase-3表达;TUNEL法检测大鼠VSMCs凋亡水平;Western blot检测VSMCs中MKK3、P38及C-myc蛋白的表达和肝脏组织中ACAT-2、Fas、HMGCR的表达水平;光镜下观察大鼠主动脉弓苏木素-伊红（HE）染色后的病理改变;大鼠肝脏组织油红O染色后观察肝脏脂质沉积情况。结果1.大鼠体重、肝脏指数的改变:实验开始时,各组大鼠体重无明显差异（P>0.05）;随着实验的进程,正常对照组大鼠体重呈现稳步增长趋势,模型组大鼠体重增长稍缓慢,体重低于正常对照组（P<0.01）;两水蛭干预组大鼠体重增长较平稳,体重高于模型组（P<0.01）,两水蛭干预组之间体重无明显差异。模型组大鼠的肝脏质量及肝脏指数明显高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）;水蛭干预组大鼠的肝脏质量及肝脏指数较模型组大鼠低,差异具有统计学意义（P<0.01）。2.大鼠血清血脂水平的变化:实验初,各组大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C差异不明显（P>0.05）;随着实验的进行直至结束,各组大鼠TG水平差异不明显（P>0.05）;第4、8周时,与正常对照组比较,模型组TC和LDL-C水平显著升高,HDL-C逐渐降低,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,水蛭高低剂量组TC和LDL-C水平明显降低,差异具有统计学意义（P<0.01）,水蛭低剂量组较高剂量组有所降低,但差异无统计学意义（P>0.05）;水蛭高低剂量组较模型组HDL-C有升高趋势,但两组间HDL-C水平在实验期间无明显差异（P>0.05）。3.血清TGF-β1表达水平的变化:模型组TGF-β1较正常对照组明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）;水蛭各干预组TGF-β1明显较模型组降低,差异均具有统计学意义（P<0.01）;两水蛭干预组组间差异无统计学意义（P>0.05）。4.大鼠VSMCs中MKK3、P38及C-myc蛋白表达的改变:与正常对照组相比较,模型组的P38和C-myc蛋白表达增加,差异具有统计学意义（P<0.01）,MKK3表达水平差异不明显,无统计学意义（P>0.05）;水蛭各干预组的MKK3、P38、C-myc蛋白表达明显较模型组降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;与水蛭低剂量组比较,水蛭高剂量组的MKK3及C-myc蛋白表达轻度增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,P38表达水平差异不具有统计学意义（P>0.05）。5.大鼠肝脏组织中ACAT-2、Fas、HMGCR的表达水平:与正常对照组比较,模型组大鼠肝脏的ACAT-2、Fas及HMGCR水平明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,水蛭高低剂量组大鼠肝脏ACAT-2、Fas及HMGCR水平明显降低,差异具有统计学意义（P<0.01）,同时,水蛭高剂量组大鼠肝脏HMGCR水平较水蛭低剂量组有降低趋势（P<0.05）,两者的ACAT-2、Fas水平无明显差异（P>0.05）。6.大鼠VSMCs中PCNA、Caspase-3表达的变化:模型组的PCNA较正常对照组明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）,Caspase-3轻度升高,但差异无统计学意义（P>0.05）;水蛭各干预组PCNA较模型组明显降低,Caspase-3明显升高,差异均具有统计学意义（P<0.01）;与水蛭低剂量组相比,水蛭高剂量组PCNA有所升高,Caspase-3有所较降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。7.大鼠VSMCs凋亡率的比较:与正常对照组相比较,模型组大鼠VSMCs凋亡阳性细胞百分比无明显差异（P>0.05）,表明正常对照组与模型对照组之间大鼠VSMCs凋亡率差异不明显;与模型组相比,中药水蛭各干预组大鼠VSMCs凋亡阳性细胞百分比明显升高（P<0.01）,表明中药水蛭干预组大鼠VSMCs凋亡率较模型组高。8.大鼠血清TGF-β1的表达水平与Caspase-3及VSMCs的凋亡率呈负相关（r分别为-0.412与-0.394）,与MKK3、PCNA、P38、C-myc、ACAT-2、Fas及HMGCR的表达水平呈正相关（r分别为0.434,0.774,0.656,0.661,0.725,0.791,0.870）,差异均具有统计学意义（P<0.05）。9.主动脉形态学改变:光镜下观察胸主动脉HE染色切片（200倍视野）,可见正常对照组大鼠主动脉内膜完整、光滑,VSMCs排列整齐,未见明显胆固醇结晶沉积及斑块形成;模型组主动脉内膜不平整,可见明显向腔内凸起的斑块,内、中膜明显增厚,VSMCs增生、排列紊乱,可见胆固醇结晶沉积,明显斑块形成;水蛭各干预组主动脉病理改变较模型组均有不同程度减轻,可见水蛭低剂量组主动脉内中膜增厚较轻,内膜下少量斑块形成,斑块内有少量胆固醇结晶,VSMCs排列较整齐,水蛭高剂量组可见少量斑块及胆固醇结晶沉积,VSMCs排列较为整齐,斑块较少。10.大鼠肝脏肉眼及油红O染色观察:正常对照组大鼠肝脏表面光滑,色泽红润,边缘较锐,呈现红褐色,质地较韧;模型组大鼠肝脏弥漫肿大感,表面光滑,边缘钝厚,呈苍白色,质软颗粒感,伴油腻感;水蛭低剂量组大鼠肝脏颜色呈淡红褐色,边缘稍钝,质软,与模型组比较,体积稍小,颗粒感、油腻感轻;水蛭高剂量组大鼠肝脏颜色稍苍白,边缘稍钝,质软,与模型组比较,体积稍小,颗粒感、油腻感轻,但肝脏颗粒感、油腻感较水蛭低剂量组明显。正常对照组大鼠肝脏未见明显脂滴沉积,模型组大鼠肝脏可见明显脂滴沉积,呈弥漫性;与模型组比较,水蛭高低剂量组大鼠肝脏脂滴沉积减少,但水蛭高剂量组大鼠肝脏脂滴沉积较水蛭低剂量组明显。结论研究结果表明中药水蛭可干预AS的发生进程,可能的机制为:1.中药水蛭可降低早期AS大鼠的血清TC及LDL-C的水平,同时可使血清中HDL-C的水平升高,进而减少大鼠血管内膜上的脂质沉积;2.经过中药水蛭的干预,大鼠肝脏指数明显降低,影响大鼠肝脏中与脂质代谢有关的酶ACAT-2、Fas及HMGCR的表达来调降血脂;3.中药水蛭可降低大鼠血清TGF-β1的表达以降低VSMCs的增殖;4.中药水蛭可降低PCNA的表达以抑制VSMCs的增殖,上调Caspase-3的表达而促进VSMCs的凋亡;5.中药水蛭可调降p38MAPK信号通路蛋白MKK3、P38及C-myc蛋白的表达水平,调控VSMCs的增殖与凋亡来影响AS进程。