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镉是主要的工业和环境污染物,对人类和其他动物均有致癌性,已被国际肿瘤研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)确定为第一类致癌物质。肝脏是镉蓄积的主要器官,也是镉损害的主要靶器官之一。但到目前为止,镉损害肝脏的确切分子机制尚不清楚,包括DNA甲基化在内的表观遗传修饰是环境有害物质损害机体或细胞的一个重要分子靶标。本研究建立了镉对大鼠原代肝细胞毒性损伤的体外模型,研究了镉对肝细胞DNA甲基化和细胞自噬的影响,初步探讨了镉损害肝脏的表观遗传学机制。1镉损伤肝细胞体外模型的建立在建立大鼠原代肝细胞体外培养的基础上,研究了不同浓度的醋酸镉对肝细胞存活率的影响。在原代肝细胞体外培养的不同时间点(4、7、10和24h),用不同浓度的醋酸镉(0、0.5、1、2和4μmol/L)处理3h,MTT法测定细胞的相对存活率。结果显示,随着镉剂量的增加,细胞的相对存活率降低。当醋酸镉浓度为4μmol/L,细胞的相对存活率为78.35%,与对照组有极显著性差异(P<0.01)；用4μmol/L醋酸镉在不用时间点处理肝细胞,与对照组相比,细胞存活率均极显著降低(P<0.01),表明镉损害肝细胞具有一定的浓度依赖性。2镉对大鼠原代肝细胞DNA甲基化的影响采用己建立的镉损伤肝细胞体外模型(4μmol/L醋酸镉处理3h),通过免疫荧光法研究了镉对肝细胞基因组DNA甲基化的影响,偏重亚硫酸氢盐测序法和结合偏重亚硫酸氢盐的限制性酶切分析研究了镉对p53、MT和LINE1基因DNA甲基化的影响,qRT-PCR研究了镉对DNMTs、P53、PARP、PNK和OGG1基因表达水平的影响。结果显示,在肝细胞体外培养过程中基因组DNA甲基化水平具有缓慢下降的趋势,镉处理加速了这种下降的趋势；维持DNA甲基化稳定的DNMTs表达水平也呈现下降的趋势,而DNA修复基因PNK和PARP以及p53的表达水平均显著升高；尽管如此,p53、MT和LINE1基因DNA甲基化均未受镉的影响。研究结果说明,镉损害肝细胞有可能是通过破坏基因组DNA甲基化的稳定来完成,虽然重金属损害的关键基因MT的DNA甲基化在镉处理之前就已经处在较低的水平,但是MT的保护作用和DNA修复机制可能不足以挽救镉对肝细胞的损伤。3镉对大鼠原代肝细胞自噬的影响自噬是细胞对部分受损细胞质或细胞器进行一系列降解的过程,被看做是细胞的保护机制。采用已建立的镉损伤肝细胞体外模型,应用Western blot和免疫荧光法分析自噬标记分子LC3的表达；在此基础上,利用雷帕霉素(Rapa)诱导自噬水平升高后,MTT法检测了镉对细胞存活率的影响。结果显示,在肝细胞体外培养过程中,镉降低了细胞自噬水平,利用激活剂增强自噬不能减弱镉的损伤。表明镉抑制了自噬对肝细胞的保护作用。