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肌萎缩性侧索硬化症（ALS）是一种常见的退行性运动神经元疾病,主要特征是皮层,脑干和脊髓中的运动神经元逐渐变性,引起肌肉萎缩无力,最终导致呼吸肌麻痹,大多病人于3-5年内死亡。ALS可以分为两种:散发性（sALS）和家族性（fALS）,其中sALS约占90%,fALS约占10%,而fALS中约五分之一由超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变引起。人类突变SOD1G93A转基因小鼠被普遍地应用于研究ALS病因、发病机制和治疗。目前ALS的发病机制尚不清楚,许多分子机制和细胞机制参与运动神经元的变性凋亡。虽然ALS不是炎症疾病,但是近年来越来越多的证据表明ALS患者和动物模型中都存在炎症反应,炎症在ALS发病机制中发挥重要作用。而且,在ALS疾病进展过程中,激活的小胶质细胞以及分泌的炎症因子,如肿瘤坏死因子α（TNFα）可以直接导致神经变性。选择性敲除小胶质细胞中的突变SOD1基因可以延长ALS疾病病程,选择性抑制小胶质细胞炎症调节因子NF-κB可以减缓运动神经元死亡和减缓疾病进展。但是目前对ALS周围神经炎症研究并不多见。基因治疗是将特定基因通过一定方式导入靶细胞,以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。腺相关病毒（AAV）载体具有长期高效表达、免疫源性低和致病性低的优势,是新研发的最常用的载体之一。胰岛素样生长因子l（IGF1）是一种分子结构与胰岛素分子类似的营养因子,通过内分泌、旁分泌和自分泌方式产生的低分子多肽。IGF1除了在细胞增殖、分化和成熟过程中发挥重要作用之外,还可以修复神经损害。SOD1G93A转基因小鼠肌肉注射携带人单链IGF1基因的腺相关病毒血清2型（AAV2-hIGF1）,其发病时间推迟,生存期延长。SOD1G93A小鼠的中枢神经系统注射携带IGF1基因的AAV2或者AAV4可以减轻其运动功能障碍,延长其生存期。我们实验室应用脊髓转导效率更高的AAV9病毒载体,通过肌肉注射和鞘内注射的给药途径均得到相似结论。我们实验室研究IGF1保护ALS小鼠的机制主要包括IGF1激活脊髓运动神经元自噬通路,使致病的SOD1蛋白水平下调,减轻了对运动神经元的毒性。另外,IGF1上调DAO水平,抑制运动神经元凋亡。之前的研究发现IGF-1可以抑制巨噬NF-κB活性发挥抗炎作用。但之前的研究多集中在IGF-1对SOD1G93A转基因小鼠的脊髓的神经元的保护作用及减轻ALS小鼠模型腰段脊髓前角中胶质细胞激活增生,很少关注IGF-1对ALS转基因小鼠坐骨神经炎症的作用。在本研究中,我们应用甲苯胺蓝、激光共聚焦和蛋白质免疫印迹的方法,观察了随疾病进展ALS小鼠模型坐骨神经病理改变,神经炎症情况。在症状前期和对照小鼠坐骨神经中髓鞘没有明显变性,无巨噬细胞浸润激活及炎症因子TNFα;随疾病进展,发病期髓鞘变性增加、巨噬细胞浸润激活及TNFα分泌增加;终末期髓鞘变性和炎症反应达到高峰。我们应用携带编码双链的人IGF1基因的AAV9（scAAV9-hIGF1）肌肉注射ALS转基因小鼠,观察到坐骨神经髓鞘变性减轻,巨噬细胞浸润激活减少,炎症因子TNFα分泌减少。我们发现IGF1减轻ALS小鼠坐骨神经炎症。为了证实该发现,我们进一步应用CRISPR-Cas9系统敲除ALS转基因小鼠中IGF1基因,ALS小鼠坐骨神经病理和炎症加重。IGF1除了可以减轻腰髓炎症反应外,我们首次观察到IGF1也减轻ALS转基因小鼠模型坐骨神经炎症。第一部分ALS-SOD1G93A转基因小鼠坐骨神经的炎症变化目的:观察正常小鼠及ALS转基因小鼠不同疾病时期（症状前期、发病期、终末期）坐骨神经的病理变化、巨噬细胞激活浸润情况及炎症因子的表达情况。方法:我们选取来自美国Jackson实验室的SOD1G93A转基因小鼠为动物模型,在恒温、恒湿、无特殊病原菌（SPF）级的动物房中进行饲养和繁殖,应用美国Jackson实验室提供的引物序列和鉴定方法对雌性小鼠进行基因鉴定,根据DNA鉴定结果分为SODl G93A阳性的转基因小鼠和SODG93A阴性的同窝配对（littermate）。选取SOD1G93A阴性小鼠（littermate,130-150天）9只,SOD1G93A阳性小鼠27只,阳性小鼠依据病程分为症状前期（presymptom,60天）9只,发病期（onset,100-120天）9只,终末期（ending,130-150天）9只,小鼠分别用5%戊二醛灌注固定取材（3只/组）、4℃的4%多聚甲醛灌注固定取材（3只/组）或直接新鲜取材（3只/组）。通过甲苯胺蓝染色观察小鼠坐骨神经病理改变;通过免疫荧光染色方法,观察坐骨神经中巨噬细胞浸润和激活;通过Western blot方法,检测小鼠坐骨神经中CD11b,CD68及TNFα蛋白表达变化。结果:1.对照组小鼠的坐骨神经所有神经髓鞘形态完整,无明显的髓鞘变性,未见吞噬细胞存在;与对照小鼠相比,症状前期小鼠坐骨神经无明显差别;随着疾病进展,发病期小鼠的坐骨神经髓鞘部分变性,伴随散在的吞噬变性髓鞘的吞噬细胞;终末期小鼠坐骨神经损害严重,髓鞘崩解,有髓髓鞘减少,大量吞噬变性髓鞘的吞噬细胞沿坐骨神经长轴分布。2.对照组小鼠坐骨神经中未见明显巨噬细胞浸润和激活;与对照小鼠相比,症状前期小鼠坐骨神经中巨噬细胞浸润和激活情况变化不明显;发病期小鼠坐骨神经巨噬细胞浸润和激活增加;随着疾病的进展,终末期小鼠坐骨神经中浸润并激活达到高峰。3.对照组小鼠表达较低水平的TNFα;症状前期小鼠坐骨神经中TNFα水平与对照小鼠没有差别;发病期的小鼠坐骨神经表达TNFα水平上调;随疾病进展,终末期小鼠坐骨神经中TNFα水平达到高峰。第二部分肌肉注射scAAV9-hIGF1减轻ALS-SOD1G93A转基因小鼠坐骨神经炎症目的:观察肌肉注射scAAV9-hIGF1后,ALS转基因小鼠坐骨神经病理、巨噬细胞浸润激活和炎症因子TNFα的变化。方法:我们选取来自美国Jackson实验室的SOD1G93A小鼠为动物模型,在恒定温度、恒定湿度且无特殊病原菌的动物房中饲养、繁殖。随机将9对90天ALS转基因小鼠给予鞘内注射scAAV9-hIGF1及scAAV9-GFP。于110天左右,小鼠分别用5%戊二醛灌注固定取材（3只/组）、4℃的4%多聚甲醛灌注固定取材（3只/组）或直接新鲜取材（3只/组）。通过甲苯胺蓝染色观察小鼠坐骨神经病理改变;通过免疫荧光染色方法,观察坐骨神经中巨噬细胞浸润和激活;通过Western blot方法,检测小鼠坐骨神经中CD11b,CD68及TNFα蛋白表达变化。结果:1.AAV9-IGF1给药组小鼠较GFP对照组小鼠,坐骨神经髓鞘变性明显减少,吞噬细胞浸润减少;2.AAV9-IGF1给药组小鼠较GFP对照组小鼠,坐骨神经巨噬细胞浸润减少,巨噬细胞激活减少;3.AAV9-IGF1给药组小鼠较GFP对照组小鼠,坐骨神经炎症因子TNFα水平减低。第三部分鞘内注射scAAV9-sgRNA-IGF1-Cas9加重ALS-SOD1G93A转基因小鼠坐骨神经炎症目的:观察鞘内注射scAAV9-sgRNA-IGF1-Cas9后的ALS小鼠坐骨神经病理、巨噬细胞浸润激活和炎症因子TNFα的变化。方法:我们选取来自美国Jackson实验室的SOD1G93A小鼠为动物模型,在恒定温度、恒定湿度且无特殊病原菌的动物房中饲养、繁殖。随机将9组30天ALS转基因雌性小鼠给予鞘内注射scAAV9-sgRNA-IGF1-Cas9及scAAV9-sgRNA-lacz-Cas9,于110天左右,小鼠分别用5%戊二醛灌注固定取材（3只/组）、4℃的4%多聚甲醛灌注固定取材（3只/组）或直接新鲜取材（3只/组）。通过甲苯胺蓝染色观察小鼠坐骨神经病理改变;通过免疫荧光染色方法,观察坐骨神经中巨噬细胞浸润和激活;通过Western blot方法,检测小鼠坐骨神经中CD11b,CD68及TNFα蛋白表达变化。结果:1.sc AAV9-sgRNA-IGF1-Cas9给药组小鼠较scAAV9-sgRNA-lacz-Cas9对照组小鼠,坐骨神经髓鞘变性明显增加,吞噬细胞浸润增多;2.sc AAV9-sgRNA-IGF1-Cas9给药组小鼠较scAAV9-sgRNA-lacz-Cas9对照组小鼠,坐骨神经巨噬细胞浸润增多,巨噬细胞激活增多;3.sc AAV9-sgRNA-IGF1-Cas9给药组小鼠较scAAV9-sgRNA-lacz-Cas9对照组小鼠,坐骨神经炎症因子TNFα水平升高。结论:1.本研究采用国际公认的ALS小鼠模型即SOD1G93A转基因小鼠,通过免疫荧光染色观察到随着疾病进展,SOD1G93A转基因小鼠坐骨神经中巨噬细胞浸润激活逐渐增强,通过蛋白印迹分析发现巨噬细胞标记蛋白CD11b、巨噬细胞激活标记蛋白CD68及炎症因子TNFα随疾病进展逐渐增加,从而证实了SOD1G93A转基因小鼠除腰段脊髓存在神经炎症外,坐骨神经也存在神经炎症,可能为ALS治疗提供新的靶点。2.以往研究发现IGF1减轻SOD1G93A转基因小鼠腰髓小胶质细胞激活,与之相一致,我们通过肌肉注射方式给予ALS小鼠scAAV9-IGF1后,小鼠坐骨神经中巨噬细胞浸润激活减少,炎症因子TNFα水平降低,提示了IGF1对ALS转基因小鼠坐骨神经神经炎症的治疗作用。3.通过鞘内注射scAAV9-sgRNA-IGF1-Cas9敲降SOD1G93A转基因小鼠的IGF1后,小鼠坐骨神经中髓鞘变性加重,巨噬细胞浸润激活增加,炎症因子TNFα水平升高,进一步提示IGF1对ALS坐骨神经神经炎症的治疗作用。